非受體酪氨酸激酶c-Abl抑制劑誘導(dǎo)線粒體損傷并抑制線粒體自噬.pdf

1、c-Abl(cellular Abelson gene product，c-Abl)是非受體酪氨酸激酶超家族Abelson的成員，在細胞生長和生存的許多重要信號通路，如細胞骨架重塑、細胞遷移和粘附、受體內(nèi)吞作用、自噬、DNA損傷反應(yīng)和細胞凋亡、促進自噬體進入溶酶體以及溶酶體組件的正常工作等方面都有重要作用。受到氧化壓力刺激，c-Abl進入線粒體可以介導(dǎo)線粒體功能損傷和細胞死亡。正常情況下，細胞內(nèi)c-Abl活性比較低，電離輻射或氧化應(yīng)激時

2、被激活。由于染色體易位形成BCR-Abl融合基因，其編碼的BCR-ABL融合蛋白呈組成性激活狀態(tài)，是導(dǎo)致慢性粒細胞性白血病(CML)的主要原因。c-Abl的抑制劑STI571（又稱伊馬替尼，格列衛(wèi)）是90年代開發(fā)的酪氨酸激酶抑制劑類藥物，是全世界第一個靶向小分子藥物，在BCR-Abl陽性急、慢性白血病的治療中發(fā)揮了重要作用。持續(xù)使用該藥的病人，其預(yù)期壽命已與正常人群沒有顯著區(qū)別。有文獻中已經(jīng)報道STI571可以升高細胞的活性氧水平，同時

3、將表皮生長因子抑制劑聯(lián)合STI571用藥可協(xié)同促進非小細胞肺癌細胞凋亡。
　　線粒體是真核細胞氧化產(chǎn)能的重要場所，它通過內(nèi)膜上的呼吸鏈復(fù)合物之間的協(xié)作，氧化還原呼吸作用底物并耦合電子傳遞產(chǎn)生ATP。在線粒體和亞線粒體顆粒以及完整的細胞中，呼吸作用除了可以維持細胞正常代謝之外，不可避免會產(chǎn)生一些活性氧族如H2O2、超氧陰離子、氫自由基及羥基自由基。特別是當線粒體呼吸作用受到抑制或者功能紊亂時，會大量產(chǎn)生活性氧族。線粒體產(chǎn)生的活性氧族

4、對細胞會產(chǎn)生毒性，誘使細胞死亡。線粒體受到損傷后，其表面蛋白會被泛素修飾，并與溶酶體融合，以清除受損傷的線粒體，該過程被稱為線粒體自噬(Mitophagy)。
　　凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF）定位于線粒體內(nèi)膜上，是呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的組成部分，具有維持線粒體穩(wěn)態(tài)和促凋亡雙重作用。正常生理條件下，AIF作為依賴于NADH的氧化還原酶，參與呼吸作用;當線粒體受損時，AIF經(jīng)特定蛋白酶切割，從線

5、粒體內(nèi)膜脫離并轉(zhuǎn)移到細胞核，引發(fā)染色體凝聚和DNA片段化，從而誘導(dǎo)細胞凋亡。但是AIF對細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生及線粒體自噬的關(guān)系尚無相關(guān)報道。
　　實驗室前期研究結(jié)果已證實c-Abl能夠與AIF相互作用，且導(dǎo)致AIF磷酸化。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，首先通過免疫共沉淀，純化在c-Abl表達細胞中表達的Flag-AIF，SDS-PAGE電泳分離出AIF蛋白，切取含有AIF的蛋白膠塊，通過LC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)AIF蛋白的Y1

6、70和Y253可以被磷酸化。為進一步研究c-Abl對AIF的Y170和Y253位點的特異性磷酸化，針對Y170和Y253這兩個酪氨酸磷酸化位點，我們合成了磷酸化的多肽，通過免疫家兔制備了相應(yīng)的位點特異性磷酸化抗體，AIF-Y(170)-p-Tyr和AIF-Y(253)-p-Tyr。通過Y(170F)、Y(253F)單一突變體和Y(170253F)雙突變體的免疫印記實驗，驗證這兩個位點的特異性磷酸化。
　　為研究c-Abl磷酸化AI

7、F的生物學(xué)意義，我們設(shè)計并合成干擾AIF基因表達的siRNA序列，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝、轉(zhuǎn)染到A549細胞中，用嘌呤霉素篩選出基因組整合有干擾序列siRNA的陽性克隆株，并通過免疫印記驗證，AIF基因表達水平降低80％以上，成功構(gòu)建了AIF敲低的A549穩(wěn)定細胞系。采用免疫熒光技術(shù)，綠色熒光二抗FITC標記AIF，紅色Mitotracker red染料標記線粒體，在鏡下觀察發(fā)現(xiàn)AIF敲低的線粒體有片段化損傷現(xiàn)象。
　　實驗室前期

8、研究結(jié)果已證實c-Abl抑制劑STI571能夠造成線粒體損傷，進一步研究這一現(xiàn)象，我們發(fā)現(xiàn)c-Abl抑制劑STI571誘導(dǎo)非小細胞肺癌細胞等細胞的線粒體片段化甚至嚴重的腫脹損傷具有時間和劑量上的依賴性，提示我們c-Abl抑制劑STI571對于線粒體的損傷可能與AIF的定位改變有關(guān)。另一方面，通過免疫印記實驗發(fā)現(xiàn)，STI571可以抑制c-Abl對AIF的磷酸化。為了探究c-Abl抑制劑STI571對于線粒體的損傷與AIF定位的關(guān)系，利用本

9、實驗室前期將AIF基因序列上C端的線粒體定位序列(MLS)替換為線粒體內(nèi)膜錨定序列COX-Ⅳ并插入GFP標簽載體上，構(gòu)建的融合表達蛋白COX-AIF-GFP，使AIF能夠錨定在線粒體內(nèi)膜上而不被水解脫離線粒體。通過外源表達COX-AIF-GFP，免疫熒光實驗觀察到錨定在線粒體上的AIF可以緩解STI571對于線粒體的損傷。表明AIF在線粒體上的定位改變是c-Abl抑制劑STI571造成線粒體損傷的一個原因。
　　為了研究AIF對S

10、TI571升高細胞ROS水平的影響，我們采用流式細胞術(shù)聯(lián)合活性氧熒光探針DCFH來測定STI571處理AIF敲低的A549細胞系的平均ROS值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在敲低AIF的A549細胞中，STI571仍然可以大幅度升高ROS水平。表明的AIF可能對STI571誘導(dǎo)細胞ROS水平升高沒有顯著的影響。
　　損傷線粒體可以和溶酶體融合得到清除。我們采用免疫熒光技術(shù)和溶酶體標志物LC3標記溶酶體的方法，在激光共聚焦顯微鏡下觀察線粒體解偶聯(lián)劑CC

11、CP(20μM，6h，12h，24h)時間梯度處理、尼洛替尼（AMN，25μM，24h）的單一處理組和CCCP(20μM，24h)和另一種c-Abl抑制劑尼洛替尼（25μM，24h）聯(lián)合處理研究c-Abl抑制劑尼洛替尼對A549細胞線粒體的自噬過程影響。我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，隨著CCCP處理時間的延長，聚集在線粒體上的LC3顆粒呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢，體現(xiàn)了線粒體自噬體的形成和逐漸被降解的過程。相比于CCCP(6～24h)梯度處理組，

12、尼洛替尼單一處理也出現(xiàn)了線粒體上LC3顆粒數(shù)量增加，表明它同樣可以誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生;但是對比CCCP單一處理(20μM，24h) LC3顆粒大量減少，尼洛替尼和CCCP共處理組24h則明顯出現(xiàn)更多的LC3顆粒，表明不斷形成的自噬體被滯留在溶酶體中而未被降解，最終導(dǎo)致自噬流的抑制。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)c-Abl抑制劑誘導(dǎo)線粒體活性氧水平升高可能與c-Abl磷酸化AIF無顯著想關(guān)性;c-Abl抑制劑可以通過調(diào)控AIF在線粒體