非受體酪氨酸激酶c-Abl抑制劑誘導(dǎo)線粒體損傷并抑制線粒體自噬.pdf

1、c-Abl(cellular Abelson gene product，c-Abl)是非受體酪氨酸激酶超家族Abelson的成員，在細(xì)胞生長和生存的許多重要信號通路，如細(xì)胞骨架重塑、細(xì)胞遷移和粘附、受體內(nèi)吞作用、自噬、DNA損傷反應(yīng)和細(xì)胞凋亡、促進(jìn)自噬體進(jìn)入溶酶體以及溶酶體組件的正常工作等方面都有重要作用。受到氧化壓力刺激，c-Abl進(jìn)入線粒體可以介導(dǎo)線粒體功能損傷和細(xì)胞死亡。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)c-Abl活性比較低，電離輻射或氧化應(yīng)激時(shí)

2、被激活。由于染色體易位形成BCR-Abl融合基因，其編碼的BCR-ABL融合蛋白呈組成性激活狀態(tài)，是導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)的主要原因。c-Abl的抑制劑STI571（又稱伊馬替尼，格列衛(wèi)）是90年代開發(fā)的酪氨酸激酶抑制劑類藥物，是全世界第一個(gè)靶向小分子藥物，在BCR-Abl陽性急、慢性白血病的治療中發(fā)揮了重要作用。持續(xù)使用該藥的病人，其預(yù)期壽命已與正常人群沒有顯著區(qū)別。有文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道STI571可以升高細(xì)胞的活性氧水平，同時(shí)

3、將表皮生長因子抑制劑聯(lián)合STI571用藥可協(xié)同促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡。
　　線粒體是真核細(xì)胞氧化產(chǎn)能的重要場所，它通過內(nèi)膜上的呼吸鏈復(fù)合物之間的協(xié)作，氧化還原呼吸作用底物并耦合電子傳遞產(chǎn)生ATP。在線粒體和亞線粒體顆粒以及完整的細(xì)胞中，呼吸作用除了可以維持細(xì)胞正常代謝之外，不可避免會(huì)產(chǎn)生一些活性氧族如H2O2、超氧陰離子、氫自由基及羥基自由基。特別是當(dāng)線粒體呼吸作用受到抑制或者功能紊亂時(shí)，會(huì)大量產(chǎn)生活性氧族。線粒體產(chǎn)生的活性氧族

4、對細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒性，誘使細(xì)胞死亡。線粒體受到損傷后，其表面蛋白會(huì)被泛素修飾，并與溶酶體融合，以清除受損傷的線粒體，該過程被稱為線粒體自噬(Mitophagy)。
　　凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF）定位于線粒體內(nèi)膜上，是呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的組成部分，具有維持線粒體穩(wěn)態(tài)和促凋亡雙重作用。正常生理?xiàng)l件下，AIF作為依賴于NADH的氧化還原酶，參與呼吸作用;當(dāng)線粒體受損時(shí)，AIF經(jīng)特定蛋白酶切割，從線

5、粒體內(nèi)膜脫離并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，引發(fā)染色體凝聚和DNA片段化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但是AIF對細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生及線粒體自噬的關(guān)系尚無相關(guān)報(bào)道。
　　實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果已證實(shí)c-Abl能夠與AIF相互作用，且導(dǎo)致AIF磷酸化。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，首先通過免疫共沉淀，純化在c-Abl表達(dá)細(xì)胞中表達(dá)的Flag-AIF，SDS-PAGE電泳分離出AIF蛋白，切取含有AIF的蛋白膠塊，通過LC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)AIF蛋白的Y1

6、70和Y253可以被磷酸化。為進(jìn)一步研究c-Abl對AIF的Y170和Y253位點(diǎn)的特異性磷酸化，針對Y170和Y253這兩個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，我們合成了磷酸化的多肽，通過免疫家兔制備了相應(yīng)的位點(diǎn)特異性磷酸化抗體，AIF-Y(170)-p-Tyr和AIF-Y(253)-p-Tyr。通過Y(170F)、Y(253F)單一突變體和Y(170253F)雙突變體的免疫印記實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證這兩個(gè)位點(diǎn)的特異性磷酸化。
　　為研究c-Abl磷酸化AI

7、F的生物學(xué)意義，我們設(shè)計(jì)并合成干擾AIF基因表達(dá)的siRNA序列，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝、轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，用嘌呤霉素篩選出基因組整合有干擾序列siRNA的陽性克隆株，并通過免疫印記驗(yàn)證，AIF基因表達(dá)水平降低80％以上，成功構(gòu)建了AIF敲低的A549穩(wěn)定細(xì)胞系。采用免疫熒光技術(shù)，綠色熒光二抗FITC標(biāo)記AIF，紅色Mitotracker red染料標(biāo)記線粒體，在鏡下觀察發(fā)現(xiàn)AIF敲低的線粒體有片段化損傷現(xiàn)象。
　　實(shí)驗(yàn)室前期

8、研究結(jié)果已證實(shí)c-Abl抑制劑STI571能夠造成線粒體損傷，進(jìn)一步研究這一現(xiàn)象，我們發(fā)現(xiàn)c-Abl抑制劑STI571誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞等細(xì)胞的線粒體片段化甚至嚴(yán)重的腫脹損傷具有時(shí)間和劑量上的依賴性，提示我們c-Abl抑制劑STI571對于線粒體的損傷可能與AIF的定位改變有關(guān)。另一方面，通過免疫印記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，STI571可以抑制c-Abl對AIF的磷酸化。為了探究c-Abl抑制劑STI571對于線粒體的損傷與AIF定位的關(guān)系，利用本

9、實(shí)驗(yàn)室前期將AIF基因序列上C端的線粒體定位序列(MLS)替換為線粒體內(nèi)膜錨定序列COX-Ⅳ并插入GFP標(biāo)簽載體上，構(gòu)建的融合表達(dá)蛋白COX-AIF-GFP，使AIF能夠錨定在線粒體內(nèi)膜上而不被水解脫離線粒體。通過外源表達(dá)COX-AIF-GFP，免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察到錨定在線粒體上的AIF可以緩解STI571對于線粒體的損傷。表明AIF在線粒體上的定位改變是c-Abl抑制劑STI571造成線粒體損傷的一個(gè)原因。
　　為了研究AIF對S

10、TI571升高細(xì)胞ROS水平的影響，我們采用流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)合活性氧熒光探針DCFH來測定STI571處理AIF敲低的A549細(xì)胞系的平均ROS值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在敲低AIF的A549細(xì)胞中，STI571仍然可以大幅度升高ROS水平。表明的AIF可能對STI571誘導(dǎo)細(xì)胞ROS水平升高沒有顯著的影響。
　　損傷線粒體可以和溶酶體融合得到清除。我們采用免疫熒光技術(shù)和溶酶體標(biāo)志物L(fēng)C3標(biāo)記溶酶體的方法，在激光共聚焦顯微鏡下觀察線粒體解偶聯(lián)劑CC

11、CP(20μM，6h，12h，24h)時(shí)間梯度處理、尼洛替尼（AMN，25μM，24h）的單一處理組和CCCP(20μM，24h)和另一種c-Abl抑制劑尼洛替尼（25μM，24h）聯(lián)合處理研究c-Abl抑制劑尼洛替尼對A549細(xì)胞線粒體的自噬過程影響。我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，隨著CCCP處理時(shí)間的延長，聚集在線粒體上的LC3顆粒呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢，體現(xiàn)了線粒體自噬體的形成和逐漸被降解的過程。相比于CCCP(6～24h)梯度處理組，

12、尼洛替尼單一處理也出現(xiàn)了線粒體上LC3顆粒數(shù)量增加，表明它同樣可以誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生;但是對比CCCP單一處理(20μM，24h) LC3顆粒大量減少，尼洛替尼和CCCP共處理組24h則明顯出現(xiàn)更多的LC3顆粒，表明不斷形成的自噬體被滯留在溶酶體中而未被降解，最終導(dǎo)致自噬流的抑制。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)c-Abl抑制劑誘導(dǎo)線粒體活性氧水平升高可能與c-Abl磷酸化AIF無顯著想關(guān)性;c-Abl抑制劑可以通過調(diào)控AIF在線粒體