利用柞蠶核型多角體病毒表達(dá)載體系統(tǒng)表達(dá)人生長(zhǎng)激素的研究.pdf

1、柞蠶核型多角體病毒(ApNPV)屬昆蟲(chóng)桿狀病毒，可專一性感染柞蠶。利用這一特點(diǎn)研發(fā)的ApNPV表達(dá)載體系統(tǒng)已在柞蠶蛹中成功表達(dá)綠色熒光蛋白基因，但尚沒(méi)有表達(dá)具有生物學(xué)活性的蛋白的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次利用柞蠶核型多角體病毒(ApNPV)表達(dá)載體系統(tǒng)分析人生長(zhǎng)激素基因（hgh）在柞蠶蛹體中的表達(dá)。構(gòu)建了轉(zhuǎn)移表達(dá)載體pApM748BE/hgh，將轉(zhuǎn)移表達(dá)載體質(zhì)粒DNA與病毒ApNP V-⊿ph/egfp+基因組DNA共轉(zhuǎn)染樗蠶（Philosami

2、a cynthiam，Pc）培養(yǎng)細(xì)胞Pc-01，用末端稀釋法篩選獲得重組病毒ApNPV-⊿ph/⊿ egfp/hgh+。將該重組病毒感染柞蠶蛹，采用Western-blot和ELISA方法檢測(cè)分析人生長(zhǎng)激素蛋白(hGH)在柞蠶蛹中的表達(dá)，結(jié)果顯示:在柞蠶蛹感染重組病毒ApNPV-⊿ph/⊿egfp/hgh+后第7天，hGH就有明顯的表達(dá);感染后13～14天蛹體液中的hGH含量保持較高水平，感染第15天至20天，仍可以檢測(cè)到hGH的表達(dá)，

3、但表達(dá)產(chǎn)物出現(xiàn)降解現(xiàn)象;重組hGH最高表達(dá)量可達(dá)251.18μg/mL柞蠶蛹體液。
　　用活化的人紅白血病細(xì)胞K562測(cè)定重組hGH的體外活性，檢測(cè)結(jié)果顯示柞蠶蛹表達(dá)重組hGH對(duì)人紅白血病細(xì)胞K562具有明顯的促進(jìn)增殖作用。對(duì)重組hGH進(jìn)行了初步分離操作，確定重組hGH的最佳硫酸銨鹽析濃度為35％。驗(yàn)證了利用免疫親和層析從感染了重組柞蠶核型多角體病毒的柞蠶蛹體內(nèi)分離純化重組hGH的可行性。本實(shí)驗(yàn)利用蠶蛹高效表達(dá)有生物活性的hGH，