密花石斛多糖DDP-1-D的分離純化及結(jié)構(gòu)表征.pdf

1、石斛是常用名貴中藥材，《神農(nóng)本草經(jīng)》更將其列為上品。我國有石斛屬(Dendrobium)植物76種以上，其中作為藥用的40多種。石斛具有滋陰清熱、生津益胃、明目利嗓等功能，用于熱病傷津、口干煩渴、病后虛熱等多種病癥。現(xiàn)代藥理表明，石斛具有治療白內(nèi)障、胃腸功能紊亂和降血糖等作用，臨床應(yīng)用廣泛。它的有效成分主要是多糖和生物堿，其中多糖由于具有抗氧化、增強免疫力和抗腫瘤作用而成為研究熱點。目前石斛大多來源于金釵石斛、鐵皮石斛、細莖石斛及迭鞘石

2、斛等，由于這些藥用石斛的資源比較緊張，處于供不應(yīng)求狀況，這對石斛多糖的深入開發(fā)研究不利。密花石斛(Dendrobiumdensiflorum)在我國的廣東、海南、廣西等地分布較廣，產(chǎn)量相對較高，目前已成為藥用石斛的主要代用品之一，被《貴州省中藥材標準》(1988版)和《江蘇省中藥材標準》(1998版)收載。本課題選用密花石斛為原料，采用正交設(shè)計試驗優(yōu)選密花石斛水溶性多糖的提取工藝。在此基礎(chǔ)上，通過DEAE-52纖維素柱和凝膠柱色譜對總多

3、糖進行純化，獲取密花石斛均(一)多糖，研究密花石斛均(一)多糖的理化性質(zhì)及相對分子質(zhì)量、單糖組成等一級結(jié)構(gòu)表征，為進一步探討密花石斛多糖的藥理作用機理奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，也可為密花石斛多糖在藥品領(lǐng)域的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。
　　 一.正交設(shè)計優(yōu)選密花石斛多糖提取工藝研究
　　 以提取密花石斛多糖含量為評價指標，采用正交設(shè)計試驗L9(34)，選擇溫度、加水量（倍）、提取次數(shù)及提取時間(h)為考察因素，對影響密花石斛多糖提取工藝的

4、因素進行了研究。干燥的密花石斛莖粉末依次用丙酮、甲醇索式提取脫脂。取脫脂密花石斛干燥粉末，按正交設(shè)計方案提取，水提醇沉，用Sevag試劑去蛋白。水溶液部分透析，冷凍干燥，獲得密花石斛粗多糖，準確稱重。按照苯酚-硫酸法檢測多糖的含量。各因素對密花石斛多糖提取工藝的影響作用程度分別為加熱溫度＞提取次數(shù)＞提取時間＞加水倍數(shù)。因此確定密花石斛多糖較佳提取工藝為90℃、加水20倍、提取3次、每次2h?？紤]到能耗與后處理簡便起見，最適宜的密花石斛多

5、糖提取工藝條件調(diào)整為90℃、加水10倍、提取3次、每次2h。驗證試驗，結(jié)果顯示該方法具有良好的重現(xiàn)性(RSD=0.027)。在此工藝條件下多糖提取得率3.15％。
　　 二.密花石斛多糖的提取分離純化及UV、FTIR分析
　　 脫脂密花石斛干燥粉末加10倍量水于干燥的密花石斛殘留物中90℃提取3次，每次2h。抽濾，濾液合并減壓濃縮，加4倍量95％乙醇4℃靜置過夜，3000rpm離心5min后，沉淀重復水溶醇沉2次。沉淀用

6、去離子水復溶，用Sevag試劑去蛋白4次，水溶液部分裝入透析袋(截留分子量:3500Da)在去離子水中透析48h，透析袋內(nèi)溶液經(jīng)10000rpm離心10min，上清液冷凍干燥，獲得密花石斛粗多糖DDP，DDP通過DEAE-52纖維素離子交換柱NaCl階段洗脫分離得中性糖DDP-1以及5個酸性糖DDP-2、3、4、5、6。中性糖組分DDP-1過SephacrylS-200柱分級純化后，得DDP-1-A，DDP-1-B，DDP-1-C，DD

7、P-1-D和DDP-1-E。DDP-1-C、DDP-1-D及DDP-1-E的水溶液，經(jīng)UV-Vis分光光譜儀掃描，波長范圍為200-800nm，DDP-1-C、DDP-1-D和DDP-1-E在260nm處沒有吸收峰，說明不含核酸成分;在280nm處，曲線基本上平滑，表明3個多糖組分基本不含蛋白質(zhì)。密花多糖樣品DDP-1-C、DDP-1-D和DDP-1-E分別經(jīng)FT-IR光譜儀掃描，掃描范圍為4000～400cm-1。位于3500～330

8、0cm-1的特征峰是糖分子O-H的伸縮振動，3000～2800cm-1的一組峰是糖分子C-H的伸縮振動，1200～1000cm-1處的吸收峰為C-O-C環(huán)內(nèi)醚中的C-O伸縮振動和C-O-H的O-H變角振動。<參考文獻>=3個多糖組分都具有這三組峰，確證為多糖化合物。另外，在1653～1639cm-1處為水的振動吸收峰;938cm-1處吸收峰為α-D-Glc的特征吸收峰，897cm-1吸收峰為β-端基差向異構(gòu)的C-H變角振動，869和81

9、6cm-1是D-Man的特征吸收峰。DDP-1-C，DDP-1-D和DDP-1-E均為含葡聚甘露糖，其糖環(huán)為吡喃型。
　　 三.密花石斛中性多糖DDP-1-D的一級結(jié)構(gòu)表征研究
　　 首次從密花石斛中分離獲得均一多糖DDP-1-D，經(jīng)GPC測定，DDP-1-D的平均分子質(zhì)量為9440Da，其比旋光度為[α]20D+119.19°。綜合各種色譜和光譜分析UV、IR、TLC、GC-MS、1H-NMR、13C-NMR、2D-N

10、MR(COSY,TOCSY,HSQC和HMBC)，以及高碘酸氧化-Smith降解的分析結(jié)果，可知多糖DDP-1-D是葡聚甘露糖，主要由D-Glc和D-Man按3.01:1比例組成。每摩爾糖殘基消耗0.860molNaIO4，同時每摩爾糖殘基生成甲酸0.324mol。由此可推斷DDP-1-D中非還原性末端或(1→6)-連接的糖殘基占32.4％，(1→2)-/(1→4)-連接的糖殘基占21.2％和(1→3)-連接的糖殘基所占比例不超過46.

11、4％。氧化產(chǎn)物經(jīng)還原，水解，乙?；?，所得衍生物用GC-MS分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DDP-1-D高碘酸氧化-Smith降解后的產(chǎn)物有甘油，赤蘚醇與己糖（包括D-葡萄糖和D-甘露糖），其摩爾比為3.8:17.4:1。即DDP-1-D中存在1→3、1→4糖苷鍵，且1→3糖苷鍵、1→4糖苷鍵的摩爾比為1:17.4。其骨架由→4）-α-D-Glcp-（1→、→6）-α-D-Glcp-（1→、→2）-α-D-Manp-（1→和→4）-β-D-Manp-(1