胰島素樣生長因子-Ⅰ抑制體外培養(yǎng)的兔軟骨細胞凋亡及對細胞內(nèi)游離鈣影響的實驗研究.pdf

1、一、兔軟骨細胞的分離、培養(yǎng)和生物學特性研究 目的：獲得均一性的兔軟骨細胞。方法：機械分離乳兔關(guān)節(jié)軟骨，分切為約1mm3，用0.2％Ⅱ型膠原酶消化6h，以DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)，并以Ⅱ型膠原免疫組化染色以及Giemsa染色方法進行鑒定。結(jié)果：應(yīng)用Ⅱ型膠原免疫組化染色和Giemsa染色呈陽性，軟骨細胞體外培養(yǎng)生長良好。結(jié)論：本研究建立了簡單易行的軟骨細胞分離、培養(yǎng)方法；初代、第2代細胞生長良好.適合于實驗研究；軟骨細胞5代培養(yǎng)后，細

2、胞表型發(fā)生改變。 二、軟骨細胞二種凋亡模型的建立 目的：為了觀察藥物對骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細胞凋亡的影響建立了軟骨細胞二種凋亡模型。方法：將硝普鈉(SNAP)、全反式維甲酸(ATRA)分別加入軟骨細胞培養(yǎng)體系，建立二種不同藥物誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡模型采用吖叮橙熒光染色、DNA電泳、Annexinv/PI雙參數(shù)法以及透射電鏡對軟骨細胞凋亡進行定量、定性檢測。結(jié)果：在兔軟骨細胞培養(yǎng)體系中分別加入2mmol/L，SNAP，10-4mo

3、l/L，ATRA24h后均可成功建立軟骨細胞凋亡模型。結(jié)論：提示硝普鈉、全反式維甲酸加入軟骨細胞培養(yǎng)體系中，可建立軟骨細胞凋亡模型。 三、胰島素樣生長因子-Ⅰ抑制體外培養(yǎng)的兔軟骨細胞凋亡及bcl-2、caspase-3蛋白表達的研究目的：探討胰島素樣生長因子-1(IGF-I)對SNAP、ATRA誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡及bcl-2、caspase-3蛋白表達的影響，揭示其抗損傷作用機制，為骨關(guān)節(jié)炎治療提供理論依據(jù)。方法：制作兔軟骨細胞凋

4、亡模型。給予IGF-I10ug/L、100ug/L，應(yīng)用免疫組化染色和TUNEL法檢測bcl-2，caspase-3蛋白表達及軟骨凋亡細胞。結(jié)果：與凋亡組比較，IGF-I治療組的凋亡細胞數(shù)明顯減少，bcl-2蛋白表達明顯升高，caspase-3蛋白表達明顯降低。結(jié)論：IGF-I通過增加bcl-2蛋白表達，減少caspase-3蛋白表達，減少軟骨細胞凋亡，對骨關(guān)節(jié)炎起保護作用。 四、對SNAP、ATRA引起的兔軟骨細胞內(nèi)鈣動員拮抗

5、作用的實驗研究 目的：研究胰島素樣生長因子-Ⅰ對SNAP、ATRA引起的兔軟骨細胞動員的影響. 方法：應(yīng)用螢光指示Fura-2/AM測定細胞內(nèi)鈣離子濃度并用公式計算：[Ca2+]1=keff×(R-Rmin)/(Rmax-R).結(jié)果：100ug/LIGF-I可以抑制ATRA.10-4mol/L及SNAP2mmol/L引起的鈣動員(P＜0.01).結(jié)論：SNAP和ATRA在體外能誘導(dǎo)兔軟骨細胞調(diào)亡.IGF-I能阻礙細胞鈣離

6、子濃度上升，提示可能是治療骨關(guān)節(jié)炎的機制之一. 軟骨細胞凋亡機制研究現(xiàn)狀 細胞凋亡(apoptosis)與細胞的增殖、生長、分化一樣，是細胞生長發(fā)肓的過程，細胞凋亡之過程，大致可分為5個不同的階段：凋亡的啟動或激發(fā)；細胞內(nèi)凋亡之信號的傳導(dǎo)及調(diào)控；凋亡效應(yīng)與分子的激活；蛋白及DNA分子斷裂細胞死亡。這個過程被多種基因所控制，是多細胞有機體為調(diào)控機體發(fā)肓，維護內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞主動死亡之過程，故又稱為程序化的細胞凋

7、亡(programmedcelldeath，PCD).[1] 軟骨細胞死亡可能在外傷及骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展并可能在炎癥性關(guān)節(jié)病的關(guān)節(jié)修復(fù)中為重要的致病因素。在已有骨骼形成的機體中軟骨的兩個特征在考慮軟骨細胞死亡的后果時是十分重要的。在軟骨中無巨噬細胞，這意味著死亡細胞的殘余將在軟骨基質(zhì)中存留并可能影響基質(zhì)結(jié)構(gòu)和存活的軟骨細胞。關(guān)節(jié)軟骨也不含有間質(zhì)干細胞，并且無血管，前體細胞不能得到補充。軟骨細胞被一細胞周圍基質(zhì)包圍且個別的軟骨細胞被區(qū)域