胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ抑制體外培養(yǎng)的兔軟骨細(xì)胞凋亡及對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離鈣影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、兔軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和生物學(xué)特性研究 目的：獲得均一性的兔軟骨細(xì)胞。方法：機(jī)械分離乳兔關(guān)節(jié)軟骨，分切為約1mm3，用0.2％Ⅱ型膠原酶消化6h，以DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)，并以Ⅱ型膠原免疫組化染色以及Giemsa染色方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果：應(yīng)用Ⅱ型膠原免疫組化染色和Giemsa染色呈陽(yáng)性，軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)生長(zhǎng)良好。結(jié)論：本研究建立了簡(jiǎn)單易行的軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)方法；初代、第2代細(xì)胞生長(zhǎng)良好.適合于實(shí)驗(yàn)研究；軟骨細(xì)胞5代培養(yǎng)后，細(xì)

2、胞表型發(fā)生改變。 二、軟骨細(xì)胞二種凋亡模型的建立 目的：為了觀察藥物對(duì)骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞凋亡的影響建立了軟骨細(xì)胞二種凋亡模型。方法：將硝普鈉(SNAP)、全反式維甲酸(ATRA)分別加入軟骨細(xì)胞培養(yǎng)體系，建立二種不同藥物誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡模型采用吖叮橙熒光染色、DNA電泳、Annexinv/PI雙參數(shù)法以及透射電鏡對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡進(jìn)行定量、定性檢測(cè)。結(jié)果：在兔軟骨細(xì)胞培養(yǎng)體系中分別加入2mmol/L，SNAP，10-4mo

3、l/L，ATRA24h后均可成功建立軟骨細(xì)胞凋亡模型。結(jié)論：提示硝普鈉、全反式維甲酸加入軟骨細(xì)胞培養(yǎng)體系中，可建立軟骨細(xì)胞凋亡模型。 三、胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ抑制體外培養(yǎng)的兔軟骨細(xì)胞凋亡及bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)的研究目的：探討胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-I)對(duì)SNAP、ATRA誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡及bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)的影響，揭示其抗損傷作用機(jī)制，為骨關(guān)節(jié)炎治療提供理論依據(jù)。方法：制作兔軟骨細(xì)胞凋

4、亡模型。給予IGF-I10ug/L、100ug/L，應(yīng)用免疫組化染色和TUNEL法檢測(cè)bcl-2，caspase-3蛋白表達(dá)及軟骨凋亡細(xì)胞。結(jié)果：與凋亡組比較，IGF-I治療組的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高，caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低。結(jié)論：IGF-I通過(guò)增加bcl-2蛋白表達(dá)，減少caspase-3蛋白表達(dá)，減少軟骨細(xì)胞凋亡，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎起保護(hù)作用。 四、對(duì)SNAP、ATRA引起的兔軟骨細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員拮抗

5、作用的實(shí)驗(yàn)研究 目的：研究胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ對(duì)SNAP、ATRA引起的兔軟骨細(xì)胞動(dòng)員的影響. 方法：應(yīng)用螢光指示Fura-2/AM測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度并用公式計(jì)算：[Ca2+]1=keff×(R-Rmin)/(Rmax-R).結(jié)果：100ug/LIGF-I可以抑制ATRA.10-4mol/L及SNAP2mmol/L引起的鈣動(dòng)員(P＜0.01).結(jié)論：SNAP和ATRA在體外能誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞調(diào)亡.IGF-I能阻礙細(xì)胞鈣離

6、子濃度上升，提示可能是治療骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制之一. 軟骨細(xì)胞凋亡機(jī)制研究現(xiàn)狀 細(xì)胞凋亡(apoptosis)與細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分化一樣，是細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)肓的過(guò)程，細(xì)胞凋亡之過(guò)程，大致可分為5個(gè)不同的階段：凋亡的啟動(dòng)或激發(fā)；細(xì)胞內(nèi)凋亡之信號(hào)的傳導(dǎo)及調(diào)控；凋亡效應(yīng)與分子的激活；蛋白及DNA分子斷裂細(xì)胞死亡。這個(gè)過(guò)程被多種基因所控制，是多細(xì)胞有機(jī)體為調(diào)控機(jī)體發(fā)肓，維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡之過(guò)程，故又稱為程序化的細(xì)胞凋

7、亡(programmedcelldeath，PCD).[1] 軟骨細(xì)胞死亡可能在外傷及骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展并可能在炎癥性關(guān)節(jié)病的關(guān)節(jié)修復(fù)中為重要的致病因素。在已有骨骼形成的機(jī)體中軟骨的兩個(gè)特征在考慮軟骨細(xì)胞死亡的后果時(shí)是十分重要的。在軟骨中無(wú)巨噬細(xì)胞，這意味著死亡細(xì)胞的殘余將在軟骨基質(zhì)中存留并可能影響基質(zhì)結(jié)構(gòu)和存活的軟骨細(xì)胞。關(guān)節(jié)軟骨也不含有間質(zhì)干細(xì)胞，并且無(wú)血管，前體細(xì)胞不能得到補(bǔ)充。軟骨細(xì)胞被一細(xì)胞周?chē)|(zhì)包圍且個(gè)別的軟骨細(xì)胞被區(qū)域