益氣除痰方干預(yù)TGF-β信號(hào)途徑逆轉(zhuǎn)NSCLC上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　通過TGF-β1孵育A549細(xì)胞，構(gòu)建上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生的研究平臺(tái)，從體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證益氣除痰方可以通過干預(yù)TGF-β信號(hào)途徑，逆轉(zhuǎn)肺癌A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞增殖與侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
　　方法:
　　1.將肺腺癌細(xì)胞株A549長期暴露在10ng/mL的TGF-β1環(huán)境中，誘導(dǎo)其發(fā)生EMT，構(gòu)建肺癌細(xì)胞株A549發(fā)生EMT的研究平臺(tái)A549-M。
　　2.通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，裸鼠皮下分別接種A54

2、9細(xì)胞和A549-M細(xì)胞，建立荷瘤模型，分為A549中藥組、A549生理鹽水組、A549-M中藥組、A549-M生理鹽水組，分別給予益氣除痰方及生理鹽水灌胃21d，記錄并統(tǒng)計(jì)瘤體體積和體重，第22d處死，稱量瘤重，計(jì)算抑瘤率。瘤體組織采用Western-blot蛋白檢測法檢測EMT相關(guān)蛋白變化。
　　3.通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，MTT法檢測不同濃度含藥血清對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響;分別給予A549細(xì)胞加入空白血清、含藥血清TGF-β1(10ng

3、/mL)+空白血清、SB-431542+TGF-β1(10ng/mL)+空白血清、TGF-β1(10ng/mL)+含藥血清的不同處理，相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化;劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力;Western-blot蛋白檢測法檢測各組細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白及TGF-β信號(hào)通路蛋白Smad2/3的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.A549細(xì)胞中加入TGF-β1(10ng/mL)24h后可出現(xiàn)典型的EMT

4、形態(tài)，長期TGF-β1孵育的A549細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，撤掉TGF-β1后，形態(tài)可維持5d，隨傳代換液恢復(fù)上皮細(xì)胞形態(tài)。
　　2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:①實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與A549對(duì)照組比較，A549中藥組、A549-M中藥組的瘤重均顯著減輕(P＜0.01～0.05);與A549-M對(duì)照組比較，A549中藥組、A549-M中藥組的瘤重也均顯著減輕(P＜0.01～0.05)。A549中藥組、A549-M中藥組2組小鼠的抑瘤率分別為3

5、1.3％、29.08％。②四組裸鼠腫瘤體積均呈上升趨勢，干預(yù)第1、3、6天，各組裸鼠腫瘤體積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異; A549中藥組裸鼠腫瘤體積于干預(yù)第15天、干預(yù)第18天、干預(yù)第21天較A549對(duì)照組顯著減小(P＜0.01～0..05)，于干預(yù)第9天、干預(yù)第12天、干預(yù)第15天、干預(yù)第18天、干預(yù)第21天較A549-M對(duì)照組顯著減小(P＜0.01～0.05); A549-M中藥組裸鼠腫瘤體積于干預(yù)第12天、干預(yù)第15天、干預(yù)第18天、干預(yù)第21

6、天較A549-M對(duì)照組顯著減小(P＜0.01～0.05)，于干預(yù)第18天、干預(yù)第21天較A549對(duì)照組顯著減小(P＜0.05)。但A549-M對(duì)照組腫瘤體積與A549對(duì)照組腫瘤體積之間，A549-M益氣除痰方給藥組腫瘤體積與A549益氣除痰方給藥組腫瘤體積之間無明顯差異(P＞0.05)。體重檢測結(jié)果提示益氣除痰方可以增加裸鼠體重，但與對(duì)照組相比不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。③瘤體Western-blot蛋白檢測顯示，A549-M對(duì)照

7、組裸鼠腫瘤組織中E-cadherin的表達(dá)較A549對(duì)照組低，Vimentin的表達(dá)較之高;A549-M中藥組、A549中藥組裸鼠腫瘤組織中E-cadherin的表達(dá)分別較A549-M對(duì)照組、A549對(duì)照組低，Vimentin的表達(dá)分別較A549-M對(duì)照組、A549對(duì)照組高;A549-M對(duì)照組、A549-M中藥組裸鼠腫瘤組織中Smad2/3的表達(dá)高于A549對(duì)照組及A549中藥組，且A549-M對(duì)照組表達(dá)要高于A549-M中藥組。

8、>　　3.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:①鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)顯示，正常的A549細(xì)胞呈鋪路石樣立方形態(tài)，10ng/mL的TGF-β1作用于A549細(xì)胞24h可見細(xì)胞由立方形上皮形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)長梭形，用20％含藥血清干預(yù)后，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡且與空白血清組相比間質(zhì)化程度降低，事先加入阻滯劑SB-431542再加入10ng/mL的TGF-β1的A549細(xì)胞，與未加阻滯劑組相比，間質(zhì)化程度較低。②MTT檢測結(jié)果顯示:干預(yù)24h時(shí)，含藥血清20％組，含藥血清10％組

9、，含藥血清5％組及含藥血清2.5％組細(xì)胞增殖抑制率均較含藥血清30％組低(P＜0.01)，其余4組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;干預(yù)36h時(shí)，含藥血清10％組，含藥血清5％組，含藥血清2.5％組細(xì)胞增殖抑制率均較含藥血清20％組、含藥血清30％組低(P＜0.01)，含藥血清10％組，含藥血清5％組，含藥血清2.5％組三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;干預(yù)48h時(shí)，含藥血清10％組，含藥血清5％組，含藥血清2.5％組細(xì)胞增殖抑制率較含藥血清30％組低(P＜0.01～

10、0.05)，含藥血清2.5％組(P=0.016)較含藥血清20％組低，含藥血清20％組，含藥血清10％組，含藥血清5％組三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;干預(yù)72h時(shí)，含藥血清10％組，含藥血清5％組，含藥血清2.5％組細(xì)胞增殖抑制率均較含藥血清20％組、含藥血清30％組低(P＜0.01～0.05)，含藥血清10％組，含藥血清5％組，含藥血清2.5％組三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。給藥濃度為30％含藥血清時(shí)，干預(yù)48h，干預(yù)72h時(shí)各組細(xì)胞增殖抑制率較干預(yù)24

11、h時(shí)明顯增加(P＜0.01)，干預(yù)72h(P=0.008)時(shí)各組細(xì)胞增殖抑制率較干預(yù)36h時(shí)明顯增加;給藥濃度為20％含藥血清時(shí)，干預(yù)36h，干預(yù)48h，干預(yù)72h時(shí)各組細(xì)胞增殖抑制率較干預(yù)24h時(shí)明顯增加(P＜0.01)，干預(yù)24h，干預(yù)72h時(shí)各組細(xì)胞增殖抑制率較干預(yù)36h時(shí)明顯增加(P＜0.01～0.05);給藥濃度為10％含藥血清時(shí)，干預(yù)72h時(shí)各組細(xì)胞增殖抑制率較干預(yù)24h、干預(yù)36h時(shí)明顯增加(P＜0.05);給藥濃度為5％

12、、2.5％含藥血清時(shí)，各組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。含藥血清對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率高低與濃度高低以及作用時(shí)間長短呈相關(guān)性。③劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:空白血清組劃痕間距較TGF-β1+空白血清組、TGF-β1+含藥血清組均顯著性增加(P＜0.01～0.05);TGF-β1+空白血清組(P=0.000)劃痕間距較TGF-β1+含藥血清組顯著性減少。與空白血清組相比，TGF-β1+空白血清組遷移率為57.06％;與TGF-β1+空白血清組相比，TGF-β1+含藥血

13、清組遷移率為-56.50％;與空白血清組相比，TGF-β1+含藥血清組遷移率為14.67％。④Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:空白血清組穿膜細(xì)胞數(shù)與TGF-β1+空白血清組穿膜細(xì)胞數(shù)相比，差異具有顯著性(P=0.000);空白血清組穿膜細(xì)胞數(shù)與TGF-β1+含藥血清組穿膜細(xì)胞數(shù)相比，差異具有顯著性(P=0.003); TGF-β1+空白血清組穿膜細(xì)胞數(shù)與TGF-β1+含藥血清組穿膜細(xì)胞數(shù)相比，差異具有顯著性(P=0.000)。⑤West

14、ern-blot蛋白檢測顯示TGF-β1可以下調(diào)A549細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，而SB-431542和益氣除痰方含藥血清均可以抑制該過程，并且益氣除痰方含藥血清可以上調(diào)A549細(xì)胞的E-cadherin表達(dá);TGF-β1可以上調(diào)A549細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)，而SB-431542和益氣除痰方含藥血清均可以抑制該過程，并且益氣除痰方含藥血清可以下調(diào)A549細(xì)胞Vimentin的表達(dá);TGF-β1可以激活Sm