常山酮逆轉(zhuǎn)放射治療導致Lewis肺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制研究.pdf

1、目的:研究常山酮對放射治療所致Lewis肺癌細胞(LLC)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的逆轉(zhuǎn)作用，并探討TGF-β信號通路在此過程中作用。
　　方法:將LLC細胞系分為以下5組，空白對照組:不做任何處理;單純常山酮組:給予常山酮濃度為30ng/ml的全培養(yǎng)基培養(yǎng);單純放射治療組:給予10Gy劑量的6MV-X線單次照射;放射治療聯(lián)合常山酮組:給予常山酮濃度為30ng/ml的全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后再給予10Gy劑量的放射治療;放射治療聯(lián)合抑制

2、劑組:給予含恒定濃度TGF-β信號通路抑制劑(SB431542)的全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后再給予10Gy劑量的放射治療。分別應用ELISA、免疫熒光、Western Blot、RT-PCR等技術(shù)，研究不同處理后LLC細胞系TGF-β信號傳導通路的變化及其對LLC細胞EMT生物指標的影響，并采用細胞劃痕實驗以及Transwell侵襲轉(zhuǎn)移實驗檢測不同處理后細胞遷移和侵襲能力的變化。
　　結(jié)果:本研究通過MTT實驗最終選定TGF-β抑制劑S

3、B431542的濃度為40ug/ml。ELISA實驗結(jié)果顯示，放射治療后LLC細胞培養(yǎng)基中TGF-β水平較放射治療前升高，且放射治療后3h、6h、12h、24h時TGF-β升高水平與放射治療前相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。各處理組以開始接受放射治療時的時間點為基線，放療后6h時，單純常山酮組TGF-β水平較空白對照組明顯降低(P＜0.05），單純放射治療組TGF-β水平較空白對照組明顯升高（P＜0.05），而放射治療聯(lián)合常山

4、酮組及放射治療聯(lián)合抑制劑組較單純放射治療組TGF-β水平均明顯降低(P＜0.05）。免疫熒光結(jié)果顯示，單純放射治療后上皮標志物Cytokeratin的表達較空白對照組減少，而單純常山酮組Cytokeratin的表達較空白對照組升高，放射治療聯(lián)合常山酮組及放射治療聯(lián)合抑制劑組Cytokeratin的表達較單純放射治療組增加;單純放射治療組間質(zhì)標志物Vimentin的表達較空白對照組增多，單純常山酮組Vimentin的表達較空白對照組減少，

5、而放射治療聯(lián)合常山酮組及放射治療聯(lián)合抑制劑組Vimentin的表達較單純放射治療組減少。Western Blot結(jié)果顯示，單純放射治療組p-Smad2蛋白的表達較空白對照組升高，而單純常山酮組p-Smad2蛋白的表達較對照組降低，放射治療聯(lián)合常山酮組p-Smad2的表達水平較單純放射治療組下降;同樣，不同處理組之間Smad6蛋白的表達水平亦不相同，單純放射治療組Smad6表達較對照下降，單純常山酮組Smad6表達水平較對照組增加，放射治

6、療聯(lián)合常山酮組Smad6表達較單純放射治療組亦增加。RT-PCR結(jié)果顯示，放射治療組Twist和Snail基因表達水平較對照組明顯升高，單純常山酮組Twist和Snail基因表達水平較對照組明顯降低;而放射治療聯(lián)合常山酮組及放射治療聯(lián)合抑制劑組Twist和Snail基因表達水平較單純放射治療組降低。細胞劃痕以及Transwell侵襲轉(zhuǎn)移結(jié)果顯示，與空白對照組相比，單純常山酮組劃痕傷口愈合面積減少，Transwell小室穿膜細胞數(shù)明顯減少

7、(P＜0.05）;單純放射治療組劃痕傷口愈合面積明顯增多，Transwell小室穿膜細胞數(shù)增多（P＜0.05);與單純放射治療組相比，放射治療聯(lián)合常山酮組以及放射治療聯(lián)合抑制劑組劃痕傷口愈合面積減少，Transwell小室穿膜細胞數(shù)亦明顯減少（P＜0.05）。
　　結(jié)論:放射治療可能是通過激活TGF-β信號傳導通路引起LLC細胞發(fā)生EMT;常山酮可以抑制放射治療所致的腫瘤細胞EMT，其作用機制可能是通過抑制TGF-β信號通路實現(xiàn)的