益氣除痰方調(diào)控GRP78介導多條信號通路抑制腫瘤血管新生的機制研究.pdf

1、目的:
　　在益氣除痰方(YQCTF)前期研究基礎上，通過體內(nèi)外雙水平實驗進一步探討YQCTF對腫瘤微環(huán)境血管新生作用的分子機制及GRP78參與血管新生信號通路調(diào)控作用，為其抗腫瘤血管新生治療提供臨床應用的理論基礎。
　　方法:
　　體外細胞實驗部分:廣州中醫(yī)藥大學腫瘤中心治療抗腫瘤經(jīng)驗方YQCTF作用于人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)。(1)運用CoCl2化學誘導缺氧模擬細胞腫瘤缺氧微環(huán)境，采用CCK8法確定CoCl2

2、誘導細胞缺氧模型條件以及評估不同濃度YQCTF干預缺氧微環(huán)境下HUVEC活性的影響;(2)通過CCK8法確定YQCTF干預濃度，顯微鏡觀察細胞形態(tài)學。利用流式細胞術通過AnnexinⅤ/PI染色法檢測細胞凋亡，通過細胞DNA含量測定檢測細胞周期，觀察YQCTF對HUVEC細胞凋亡和增殖的影響;(3)采用TubeFormation實驗觀察YQCTF對缺氧HUVEC血管形成的影響;(4)利用Transwell實驗、劃痕實驗觀察YQCTF對細

3、胞遷移侵襲能力和修復能力的影響。(5)采用QPCR和WesternBlot法檢測YQCTF對缺氧HUVEC中血管新生相關通路HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAK mRN水平和蛋白表達及其磷酸化的水平研究YQCTF對血管新生的調(diào)控作用。(6)通過siRNA干擾技術沉默GRP78探討GRP78參與調(diào)控血管新生的機制研究.(7)通過免疫熒光觀察在缺氧、YQCTF干預及沉默GRP78條件下HUVEC中

4、的GRP78表達情況，探討YQCTF參與調(diào)控缺氧微環(huán)境細胞血管新生的分子機制。
　　體外動物實驗部分:選用SPF級BALB/c雄性裸鼠，構建肺腺癌A549細胞移植瘤裸鼠模型，造移植模型成功后隨機分為兩組:Control組和YQCTF組。YQCTF組給予每日YQCTF水煎液灌胃，Control組給予等體積生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥3周，期間定期觀察移植瘤裸鼠生長狀態(tài)，每3d測量裸鼠體重、瘤體體積，移植瘤裸鼠于給藥21d后處死，剝離移植瘤

5、瘤體稱量瘤重、計算抑瘤率，并觀察肺、肝轉移情況，評估YQCTF對肺癌腫瘤生長、轉移的影響;采用免疫組化法(IHC)檢測移植瘤組織微血管密度及血管新生相關信號通絡HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAK表達及其磷酸化水平。評價YQCTF對腫瘤血管新生的影響。
　　結果:
　　體外細胞實驗部分:(1) CCK8法檢測結果顯示，缺氧化學誘導劑CoCl2隨著時間延長、濃度增高，抑制細胞活力，產(chǎn)

6、生細胞毒性，選擇對細胞無明顯抑制活力和增殖的濃度進行后續(xù)實驗(100μM，48h)。當100μM的CoCl2干預48h后，細胞管腔形成、遷移及侵襲能力增強(P＜0.05，P＜0.01);(2) CCK8檢測結果提示提示YQCTF能明顯抑制缺氧HUVEC的細胞活力(P＜0.05，P＜0.01)，并與藥物濃度呈依賴性，并隨著YQCTF濃度升高，HUVEC活力下降;(3)通過倒置顯微鏡觀察HUVEC細胞形態(tài)變化，結果顯示YQCTF可抑制缺氧H

7、UVEC增殖;(4)流式細胞儀檢測AnnexinⅤ/PI染色結果提示YQCTF呈劑量依賴性誘導細胞凋亡（P＜0.05，P＜0.01），測定細胞DNA含量結果顯示YQCTF可顯著增加G0/G1期細胞的比例，降低S和G2/M比例(P＜0.05，P＜0.01)，抑制細胞分裂增殖;(5)Tube Formation實驗結果顯示YQCTF可顯著抑制細胞血管形成(P＜0.05，P＜0.01)。(6)細胞劃痕結果表明YQCTF干預可明顯抑制細胞修復能

8、力（P＜0.05，P＜0.01）。(7) Transwell實驗提示YQCT顯著降低缺氧HUVEC細胞遷移及細胞侵襲力，可抑制細胞轉移，與藥物濃度呈依賴性（P＜0.05，P＜0.01）;(8) Western blot和QPCR結果顯示，缺氧微環(huán)境可顯著上調(diào)血管新生相關通路信號分子HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAK蛋白和mRNA表達水平，并能增強AKT、ERK1/2、FAK磷酸化水平(P＜0

9、.05，P＜0.01)。YQCTF干預后，能顯著下調(diào)細胞的HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAK蛋白和mRNA表達水平，抑制AKT、ERK1/2、FAK活性，與YQCTF濃度呈依賴性降低（P＜0.05，P＜0.01），提示YQCTF可改善缺氧微環(huán)境，抑制缺氧HUVEC血管生成，其作用機理可能是通過調(diào)控上述多條信號通路表達。(9)免疫熒光結果顯示，缺氧微環(huán)境下HUVEC的GRP78表達升高。YQC

10、TF干預后細胞內(nèi)和細胞膜的GRP78熒光強度均降低;(10) siRNA轉染HUVEC沉默GRP78表達，結果顯示轉染siRNA GRP78后，HUVEC管腔形成、遷移和侵襲能力明顯降低（P＜0.01）;沉默GRP78后，血管新生相關通路蛋白HIF-1α、VEGF/VEGFR表達顯著下調(diào)，抑制AKT、ERK1/2、FAK激活(P＜0.05，P＜0.01)，提示GRP78參與血管新生進程，干預缺氧微環(huán)境，介導血管新生信號通路調(diào)控，對腫瘤生

11、長轉移發(fā)揮重要作用。(11)免疫熒光結果顯示，沉默GRP78后，胞內(nèi)和胞膜的GRP78熒光強度都明顯降低，提示GRP78可能是血管新生中重要的靶信號分子。
　　體內(nèi)動物實驗部分:(1)兩組肺癌A549細胞移植瘤裸鼠模型的體重顯示在實驗周期內(nèi)無明顯差異，YQCTF對裸鼠體重的生長無顯著抑制，YQCTF可抑制移植瘤瘤體體積(P＜0.05，P＜0.01)，抑制瘤體腫重量(P＜0.01)，顯示YQCTF對肺癌細胞移植瘤的生長有抑制作用。(

12、2)免疫組化結果顯示，YQFTF組的移植瘤組織微血管密度明顯降低（P＜0.01），提示YQCTF可抑制體內(nèi)腫瘤細胞血管新生。YQCTF組與Control組相比，可明顯抑制體內(nèi)移植瘤細胞中HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、PI3K/AKT、ERK、FAK表達及AKT、ERK1/2、FAK磷酸化水平(P＜0.05，P＜0.01)，提示YQCTF對抑制體內(nèi)腫瘤血管新生的J機制與調(diào)控HIF-1α、GRP78、VEGF/VEGFR、

13、PI3K/AKT、ERK1/2、FAK信號通路表達相關。與體內(nèi)細胞實驗結果相符。
　　結論:
　　1.成功建立缺氧內(nèi)皮細胞模型和裸鼠肺腺癌細胞移植瘤動物模型。
　　2.體外HUVEC在缺氧條件下血管新生能力增強，YQCTF可通過改缺氧微環(huán)境，抑制HUVEC增殖、管腔形成、細胞遷移和侵襲能力，降低HUVEC血管新生。體內(nèi)YQCTF能顯著降低移植瘤微血管密度，抑制血管生成，抑制肺癌細胞生長增殖。
　　3.YQCTF抗