Elf5抑制TGF-β誘導的前列腺癌上皮間質轉化的機制研究.pdf

1、目的：
　　探討Elf5在TGF-β誘導的前列腺癌上皮間質轉化的相關機制。
　　方法：
　　收集并納入124例前列腺癌病理樣本，通過免疫組化染色（IHC）和ImageJ軟件分析Elf5與E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白表達的關系。在幾種常見前列腺癌細胞系中Western Blot檢測Elf5的表達，在LNCaP細胞中用siRNA瞬時轉染將Elf5沉默使其低表達，在22Rv1細胞中通過HA-Elf5轉染將Elf5穩(wěn)定地高表達；

2、在有/無TGF-β處理的情況下，分組觀察LNCaP和22Rv1細胞的形態(tài)學變化，同時Western Blot檢測這些分組之間E-鈣粘蛋白以及反映EMT的生物標志物如N-鈣粘蛋白、Snail1、Snail2和ZEB1表達量的變化。對LNCaP和22Rv1細胞進行球形成實驗和遷移實驗觀察其錨定-非依賴生長和遷移侵襲能力是否增加。用熒光素酶報告基因實驗(Luciferase)將CAGA12或PAI-1報告基因質粒分別在HEK293和22Rv1

3、細胞中和HA-Elf5共轉染，在LNCaP細胞中和siElf5共轉染，然后用TGF-β處理并測定熒光素酶活性來判斷Elf5是否調節(jié)TGF-β信號轉導。在LNCaP細胞中檢測內源性p-SMAD2、SMAD2、p-SMAD3、SMAD3和Elf5的表達并在22Rv1細胞中驗證。在無內源性表達Elf5和SMADs的HEK293細胞中分組共轉染HA-Elf5質粒及Flag標記的vector、SMAD2、SMAD3或SMAD4質粒，免疫共沉淀判斷

4、Elf5是否與SMADs結合，并在內源性表達Elf5和SMADs的LNCaP細胞中進一步驗證。最后，對原發(fā)前列腺癌病理樣本進行p-SMAD3和TGF-β染色，分析p-SMAD3陽性率，并對Elf5和p-SMAD3與疾病進展結果之間進行生存分析。
　　結果：
　　對124例人前列腺癌成組匹配免疫組化染色發(fā)現，Elf5可使E-鈣粘蛋白表達上調，而使N-鈣粘蛋白表達下調，初步提示前列腺癌組織中Elf5可能抑制EMT的發(fā)生。Elf5

5、在LNCaP細胞高表達，在22Rv1細胞低表達；在LNCaP和22Rv1細胞中，Elf5與TGF-β對細胞形態(tài)影響呈負相關，沉默Elf5和/或用TGF-β處理可使細胞喪失極性，EMT標志物表達增加，從而使其具有更強的轉移侵襲能力；且可以促進細胞的球形成能力和遷移能力，使其多向分化能力和惡性遷移能力增加。Elf5和TGF-β對EMT的作用呈負相關，Elf5可以抑制TGF-β驅動的前列腺癌上皮間質轉化。在HEK293、LNCaP和22Rv1

6、中，Elf5均可以抑制CAGA12和PAI-1報告基因熒光素酶活性，提示Elf5可以抑制TGF-β信號通路；在LNCaP細胞中Western Blot結果顯示沉默Elf5可以促進SMAD3的磷酸化，而22Rv1細胞中過表達Elf5則可以抑制SMAD3磷酸化；在HEK293和LNCaP細胞中，免疫共沉淀結果均顯示 Elf5可以與SMAD3結合。p-SMAD3在Elf5-/TGF-βhigh前列腺癌樣本中表達顯著增高，Elf5缺失與TGF-