Elf5抑制TGF-β誘導(dǎo)的前列腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  探討Elf5在TGF-β誘導(dǎo)的前列腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)機制。
  方法:
  收集并納入124例前列腺癌病理樣本,通過免疫組化染色(IHC)和ImageJ軟件分析Elf5與E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白表達的關(guān)系。在幾種常見前列腺癌細胞系中Western Blot檢測Elf5的表達,在LNCaP細胞中用siRNA瞬時轉(zhuǎn)染將Elf5沉默使其低表達,在22Rv1細胞中通過HA-Elf5轉(zhuǎn)染將Elf5穩(wěn)定地高表達;

2、在有/無TGF-β處理的情況下,分組觀察LNCaP和22Rv1細胞的形態(tài)學變化,同時Western Blot檢測這些分組之間E-鈣粘蛋白以及反映EMT的生物標志物如N-鈣粘蛋白、Snail1、Snail2和ZEB1表達量的變化。對LNCaP和22Rv1細胞進行球形成實驗和遷移實驗觀察其錨定-非依賴生長和遷移侵襲能力是否增加。用熒光素酶報告基因?qū)嶒?Luciferase)將CAGA12或PAI-1報告基因質(zhì)粒分別在HEK293和22Rv1

3、細胞中和HA-Elf5共轉(zhuǎn)染,在LNCaP細胞中和siElf5共轉(zhuǎn)染,然后用TGF-β處理并測定熒光素酶活性來判斷Elf5是否調(diào)節(jié)TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在LNCaP細胞中檢測內(nèi)源性p-SMAD2、SMAD2、p-SMAD3、SMAD3和Elf5的表達并在22Rv1細胞中驗證。在無內(nèi)源性表達Elf5和SMADs的HEK293細胞中分組共轉(zhuǎn)染HA-Elf5質(zhì)粒及Flag標記的vector、SMAD2、SMAD3或SMAD4質(zhì)粒,免疫共沉淀判斷

4、Elf5是否與SMADs結(jié)合,并在內(nèi)源性表達Elf5和SMADs的LNCaP細胞中進一步驗證。最后,對原發(fā)前列腺癌病理樣本進行p-SMAD3和TGF-β染色,分析p-SMAD3陽性率,并對Elf5和p-SMAD3與疾病進展結(jié)果之間進行生存分析。
  結(jié)果:
  對124例人前列腺癌成組匹配免疫組化染色發(fā)現(xiàn),Elf5可使E-鈣粘蛋白表達上調(diào),而使N-鈣粘蛋白表達下調(diào),初步提示前列腺癌組織中Elf5可能抑制EMT的發(fā)生。Elf5

5、在LNCaP細胞高表達,在22Rv1細胞低表達;在LNCaP和22Rv1細胞中,Elf5與TGF-β對細胞形態(tài)影響呈負相關(guān),沉默Elf5和/或用TGF-β處理可使細胞喪失極性,EMT標志物表達增加,從而使其具有更強的轉(zhuǎn)移侵襲能力;且可以促進細胞的球形成能力和遷移能力,使其多向分化能力和惡性遷移能力增加。Elf5和TGF-β對EMT的作用呈負相關(guān),Elf5可以抑制TGF-β驅(qū)動的前列腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。在HEK293、LNCaP和22Rv1

6、中,Elf5均可以抑制CAGA12和PAI-1報告基因熒光素酶活性,提示Elf5可以抑制TGF-β信號通路;在LNCaP細胞中Western Blot結(jié)果顯示沉默Elf5可以促進SMAD3的磷酸化,而22Rv1細胞中過表達Elf5則可以抑制SMAD3磷酸化;在HEK293和LNCaP細胞中,免疫共沉淀結(jié)果均顯示 Elf5可以與SMAD3結(jié)合。p-SMAD3在Elf5-/TGF-βhigh前列腺癌樣本中表達顯著增高,Elf5缺失與TGF-

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