MiR-200c抑制TGF-β1誘導氣管上皮細胞間質轉化模型的相關研究.pdf

1、背景：
　　氣管移植是解決如原發(fā)性氣道狹窄、氣管粘膜損傷、氣管腫瘤等疾病的主要手段。而氣管移植后管腔大量纖維結締組織生成，阻塞氣管暢通，容易導致移植的失敗，因此制約氣管移植成功的關鍵是治療移植后氣管狹窄的問題。造成移植體狹窄病理因素主要包括：移植體過度纖維化形成的纖維瘢痕和氣管再軟骨化障礙，其機制尚不清楚。早期研究，利用緩釋骨形態(tài)發(fā)生蛋白與表皮生長因子促進氣管再軟骨化的形成，一定得程度上解決了維持氣管正常形態(tài)的問題，可是移植體大量

2、纖維組織增生仍然未能解決。氣管移植體中成纖維細胞和肌成纖維細胞的大量生成、排斥反應、炎性細胞的侵潤，均是誘發(fā)氣管移植體管腔中大量纖維結締組織生成的主要原因。其中有關過度生成的成纖維細胞和肌成纖維細胞的來源主要包括，第一，是氣管上皮細胞的病理轉化；第二是骨髓干細胞的分化。氣管移植體成纖維細胞和肌成纖維細胞多數由氣管上皮細胞受病理刺激后轉化而來，由骨髓干細胞分化而來的較少。上皮細胞的間質轉化(epithelial mesenchymal t

3、ransition,EMT)是上皮細胞的一種病理轉化過程，即上皮細胞失去特性而獲得間質細胞特性的轉化過程，因此氣管上皮細胞轉化成纖維細胞和肌成纖維細胞的機制是本研究的的關注點。參與組織器官的纖維化和創(chuàng)傷愈合另一個主要因素是轉化生長因子-β1（ Transforming growth factor-β1,TGF-β1），TGF-β1與受體結合，催化蛋白分子磷酸化，調節(jié)膠原蛋白、金屬蛋白酶組織抑制劑的轉錄基因表達，抑制細胞外基質降解，加強沉

4、積，還促進纖維細胞的活化，并通過自分泌的方式持續(xù)促進組織纖維化。研究證實氣管移植體狹窄處氣管粘膜中TGF-β1的表達顯著增高，因此TGF-β1增強EMT導致纖維組織過度增生，在氣管移植體狹窄病理生理過程中扮演重要角色。
　　微小RNA（MicroRNAs,MiRNAs）參與了多種細胞組織纖維增生、增殖、遷徙等生理病理過程，例如心肌纖維化、肺纖維化、腎小球纖維化、腫瘤細胞增殖遷移等，同時也在EMT的轉化過程中發(fā)揮重要的調控作用。Mi

5、RNAs家族的分子較多，MiR-200c是明星分子之一，研究表明，在其他組織器官纖維化病理過程中MiR-200c可通過TGF-β通路調節(jié)EMT相關轉錄因子的表達，來實現對EMT的調控作用。目前對氣管上皮細胞EMT過程中MiR-200c的調節(jié)作用研究較少。因此利用TGF-β1誘導的氣管上皮細胞建立上EMT的體外細胞模型，探索MiR-200c對EMT的影響是本實驗的重點。
　　目的：
　　建立氣管上皮細胞EMT的體外細胞模型，一

6、定程度上模擬氣管移植后移植體纖維結締組織過度增生導致管腔狹窄的病理改變過程；在細胞模型的基礎上，觀察MiR-200c的表達高低與TGF-β1誘導的氣管上皮細胞EMT模型的相關性，探究MiR-200c對治療氣管移植后移植體瘢痕狹窄的作用，為尋找預防和治療同種異體氣管移植后移植體狹窄的方法奠定理論基礎。
　　方法：
　　1、相同濃度TGF-β1誘導氣管上皮細胞不同時段，定量PCR法檢測上皮細胞EMT相關分子基因水平表達情況；We

7、stern-blot法和免疫熒光方法檢測上皮細胞EMT相關標志蛋白表達情況；建立氣管上皮細胞EMT模型，一定程度上模擬了氣管移植后移植體發(fā)生纖維組織過度增生的情況。
　　2、氣管上皮細胞轉染高表達或低表達MiR-200c，再由相同濃度TGF-β1誘導，用CCK-8法檢測上皮細胞增殖能力；電子顯微鏡下觀察上皮細胞形態(tài)；定量PCR法檢測上皮細胞相關EMT分子基因水平表達情況；Western-blot和免疫熒光法檢測EMT相關標志蛋白表

8、達變化情況。
　　結果：
　　1、相同濃度TGF-β1（10ng/ml）誘導氣管上皮細胞0h、24h、36h、48h，定量PCR結果提示：上皮細胞EMT相關分子基因表達中，上皮標志物E-cadherin基因表達隨時間的增加而下降，間質標志物Vimentin和α-SMA基因表達隨時間的增加而升高；Western-blot法和免疫熒光法結果提示；上皮細胞EMT相關分子蛋白表達，上皮標志蛋白E-cadherin表達隨時間的增加而下

9、降，間質標志蛋白Vimentin和α-SMA的表達隨時間的增加而升高，表明成功建立了氣管上皮細胞EMT的體外細胞模型，充分模擬了氣管移植后移植體大量纖維組織增生導致管腔狹窄的病理過程；
　　2、下調氣管上皮細胞MiR-200c表達且TGF-β1刺激誘導，CCK-8檢測上皮細胞增殖能力提示：較單獨TGF-β1誘導組，下調+ TGF-β1誘導組細胞增殖能力趨向于增殖能力強的間質細胞；倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)提示：較單獨TGF-β1誘導

10、組，下調+TGF-β1誘導組上皮細胞形態(tài)趨向于緊密連接消失的間質細胞；上調氣管上皮細胞MiR-200c表達且TGF-β1刺激誘導，CCK-8檢測上皮細胞增殖能力提示：較單獨TGF-β1誘導組，上調+ TGF-β1誘導組細胞增殖能力趨向正常上皮細胞；倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)提示：較單獨TGF-β1誘導組，上調+ TGF-β1誘導組上皮細胞形態(tài)逆轉，趨向于正常鵝卵石樣形態(tài)；
　　3、下調氣管上皮細胞MiR-200c表達且TGF-β1刺

11、激誘導，定量PCR檢測上皮細胞EMT相關分子基因表達：較單獨TGF-β1誘導組或單獨下調MiR-200c組，下調+TGF-β1誘導組上皮標志物E-cadherin基因表達量顯著下降，間質標志物Vimentin和α-SMA基因表達量顯著升高；
　　4、下調氣管上皮細胞MiR-200c表達且TGF-β1刺激誘導，Western-blot和熒光免疫法檢測上皮細胞EMT相關蛋白表達：較單獨TGF-β1誘導組或單獨下調MiR-200c組，下

12、調+TGF-β1誘導組上皮標志蛋白E-cadherin表達量下降顯著，間質標志蛋白Vimentin和α-SMA表達量顯著升高；上調氣管上皮細胞MiR-200c表達且TGF-β1刺激誘導，Western-blot和熒光免疫法檢測上皮細胞EMT相關蛋白表達：較單獨TGF-β1誘導組，上調+TGF-β1誘導組上皮標志蛋白E-cadherin蛋白表達量逆轉增加，間質標志蛋白Vimentin和α-SMA表達量逆轉下降，均有統(tǒng)計學差異；