黏膜免疫殼聚糖包裹的PsaA納米顆粒預防肺炎鏈球菌感染的實驗研究.pdf

1、研究背景:肺炎鏈球菌是引起腦膜炎、敗血癥、菌血癥性肺炎等侵襲性疾病以及中耳炎、鼻竇炎等非侵襲性疾病最為常見的一種病原體,在全球范圍內每年大約有160萬人死于肺炎鏈球菌疾病,其中大部分來自發(fā)展中國家。目前,市場上預防肺炎鏈球菌疾病的疫苗有兩類,一類是23價多糖疫苗,另一類是7價和13價多糖蛋白結合疫苗,前者對于2歲以下兒童、免疫缺陷患者和老人保護性弱,后者包含的血清型有限且易引起血清型替換。因此,研制一種無血清型限制的新型肺炎鏈球菌疫苗勢

2、在必行;肺炎鏈球菌表面黏附素A(PsaA)是存在于所有肺炎鏈球菌表面高度保守的蛋白,是一種理想的候選抗原;肺炎鏈球菌在人類主要定植于鼻咽部,通過咽鼓管途徑進入中耳引起急性中耳炎,通過呼吸道進入肺部引起肺炎,進而有可能通過血流引起菌血癥和腦膜炎,因此局部的黏膜免疫反應對于預防肺炎鏈球菌感染至關重要;黏膜免疫是一種有效的誘發(fā)局部免疫力的策略,然而鼻黏膜表面富含的纖毛、粘液,分泌的蛋白核酸酶以及上皮屏障使得抗原很難吸收,需要合適的黏膜輸送系統(tǒng)

3、或佐劑,殼聚糖(chitosan)是一種有效的黏膜輸送系統(tǒng),與蛋白或核酸結合形成納米顆粒,有利于抗原的吸收。因此,在本項研究中采用chitosan作為PsaA蛋白和核酸的黏膜輸送系統(tǒng)。
　　目的:研究chitosan包裹PsaA重組蛋白或核酸形成的納米顆粒經鼻腔黏膜途徑免疫在BALB/c小鼠體內誘導的特異性免疫應答能力以及對肺炎鏈球菌急性中耳炎、敗血癥和鼻咽部定植的保護作用。共分三部分:(1)殼聚糖包裹的PsaA重組蛋白納米顆粒的

4、制備及黏膜免疫誘生特異性免疫應答研究;(2)黏膜免疫chitosan-PsaA納米顆粒預防急性中耳炎和敗血癥研究;(3)黏膜免疫殼聚糖包裹的PsaADNA納米顆粒預防肺炎鏈球菌鼻咽部定植作用研究。
　　方法:(1)chitosan-PsaA納米顆粒的制備:PCR法從肺炎鏈球菌基因組擴增PsaA基因,與pET28a構建重組原核表達質粒pET28a-psaA,以其轉化大腸桿菌BL21,經IPTG誘導表達PsaA蛋白,親和層析獲得純化的

5、PsaA蛋白,westernblot鑒定其抗原性;采用離子交聯技術制備chitosan-PsaA納米顆粒,并檢測其粒徑及電位;(2)鼻腔接種chitosan-PsaA納米顆粒誘生免疫應答研究:將制備的chitosan-PsaA納米顆粒、裸PsaA蛋白(nPsaA)、chitosan分別鼻腔免疫BALB/c小鼠,收集鼻腔灌洗液(nasalwashes)、中耳灌洗液(MEL)及支氣管肺泡灌洗液(BALF)檢測特異性IgA抗體反應;收集血清,

6、檢測特異性IgG抗體反應;分離并培養(yǎng)脾細胞,檢測IL-17A、IL-4及IFN-γ的分泌水平;(3)chitosan-PsaA納米顆粒預防急性中耳炎研究:以chitosan-PsaA納米顆粒、裸PsaA蛋白(nPsaA)、chitosan分別鼻腔免疫BALB/c小鼠,末次免疫后2周,小鼠中耳聽泡注射14型肺炎鏈球菌,分別于攻毒后3天和7天進行中耳菌落計數及中耳組織病理學檢查,并收集中耳支氣管肺泡灌洗液;(4)chitosan-PsaA納

7、米顆粒預防敗血癥研究:以chitosan-PsaA納米顆粒、裸PsaA蛋白(nPsaA)、chitosan分別免疫BALB/c小鼠,末次免疫后2周,腹腔分別注射3型和14型肺炎鏈球菌,觀察小鼠21天內的存活率;(5)黏膜免疫保護機制探討:檢測小鼠免疫血清中特異性抗體的結合功能、抑制黏附功能以及調理吞噬功能;雙抗夾心法檢測免疫小鼠中耳攻毒前、攻毒后3天和7天支氣管肺泡灌洗液中IL-17A水平;(6)黏膜免疫殼聚糖包裹的PsaADNA納米顆

8、粒預防肺炎鏈球菌鼻咽部定植作用研究:PCR法從3型肺炎鏈球菌基因組擴增Psa,A基因,與pVAX1構建真核表達質粒pVAX1-psaA,RT-PCR及Westernblot鑒定pVAX1-psaA在體外真核細胞中的表達;復凝聚法制備chitosan-psaA納米顆粒,并檢測其粒徑及電位大小,通過與DnaseⅠ共培養(yǎng)評估chitosan保護DNA免遭降解的能力;用制備好的chitosan-psaA納米顆粒、pVAX1-psaA(naked

9、psaA)、chitosan-pVAX1分別免疫BALB/c小鼠,每兩周一次,連續(xù)4次,末次免疫后2周,收集鼻腔、中耳及支氣管肺泡灌洗液檢測特異性IgA抗體反應;收集血清檢測特異性IgG、IgG1、IgG2a抗體反應;分離并培養(yǎng)脾淋巴細胞,檢測IL-17A及工FN-γ的分泌水平;鼻腔滴入3型肺炎鏈球菌,5天后通過菌落計數評估各免疫組對肺炎鏈球菌鼻咽部定植的保護作用;收集鼻腔攻毒前及攻毒5天后的支氣管肺泡灌洗液,通過雙抗夾心法檢測IL-1

10、7A水平。
　　結果:(1)從肺炎鏈球菌基因組成功擴增PsaA編碼序列,經測序鑒定與GenBank中序列一致,成功構建pET28a-psaA原核表達質粒,并利用原核表達系統(tǒng)獲得了可溶性的PsaA蛋白,經Westernblot證實PsaA蛋白具備抗原性;成功制備了大小平均為691nm、表面電位為+21.1mV的chitosan-PsaA納米顆粒;(2)chitosan-PsaA組鼻腔黏膜免疫獲得了較高水平的全面免疫應答:鼻腔、中耳和

11、支氣管肺泡灌洗液中特異性IgA抗體水平明顯高于nPsaA和chitosan組(P＜0.05);血清中特異性IgG抗體水平明顯高于nPsaA和chitosan組(P＜0.05);經PsaA抗原刺激后脾細胞分泌的IL-17A、IL-4及IFN-γ水平明顯高于nPsaA和chirosan組(p＜0.05);(3)評估chitosan-PsaA納米顆粒對急性中耳炎的保護作用結果表明,攻毒后3天chitosan-PsaA納米顆粒組中耳的菌落計數明

12、顯少于nPsaA和chitosan組(P＜0.05),而攻毒后7天chitoan-PsaA組小鼠均無細菌定植,與chitosan組相比明顯減少(P＜0.05),nPsaA組4只小鼠有細菌定植,chitosgtn組6只小鼠有細菌定植;攻毒后3天和7天chitoan-PsaA組鼓膜的厚度和中耳炎癥細胞數均少于nPsaA和chitosan組(P＜0.05);(4)評估chitosan-PsaA納米顆粒預防敗血癥的研究結果表明,chitosan

13、-PsaA組3型14型肺炎鏈球菌小鼠的存活率均為100％,與nPsaA和chitosan組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),證實了該PsaA疫苗具有交叉保護性;(5)抗體功能實驗表明chitosan-PsaA組小鼠的血清抗體有較高的抗體結合功能、抑制黏附功能和調理吞噬功能,參與了黏膜保護機制;黏膜局部IL-17A水平在小鼠中耳攻毒3天開始升高,7天明顯升高,chitosan-PsaA組與nPsaA和chitosan組相比有明顯更高

14、水平的IL-17A(P＜0.05);(6)成功構建了pVAX1-psaA真核表達載體,經RT-PCR和Westernblot鑒定該質?？梢栽隗w外培養(yǎng)的真核細胞中表達;制備了平均大小為392nm、表面電位為+12.5mY的chitosan-psaA納米顆粒,該納米顆粒具有保護pVAX1-psaA免遭DnaseⅠ降解作用;chitosan-psaA免疫組在小鼠體內誘導產生的血清中PsaA特異性IgG、IgG1、IgG2a、粘膜IgA抗體水平

15、及IL-17A、IFN-γ水平與裸psaA組及chitosan-pVAX1組相比均明顯升高,且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);chitosan-psaA組較裸psaA組及chitosan-pVAX1組小鼠肺炎鏈球菌鼻咽部的定植量明顯降低(P＜0.05);鼻腔攻毒前黏膜IL-17A水平較低,攻毒后IL-17A水平升高,chitosan-psaA免疫組明顯高于裸psaA組及chitosan-pVAX1組(P＜0.05),提示IL-17A

16、可能參與了局部黏膜免疫,有利于肺炎鏈球菌從鼻咽部的清除。
　　結論:chitosan不論包裹PsaA蛋白疫苗還是核酸疫苗均能形成納米顆粒,該納米顆粒能夠誘導實驗動物特異性體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫應答,并對肺炎鏈球菌導致的急性中耳炎、敗血癥和鼻咽部的細菌定植具有保護作用;本研究獲得的chitosan-PsaA和chitosan-psaA納米顆粒是一種有效的黏膜免疫疫苗,以其黏膜免疫可望應用于肺炎鏈球菌感染的防治研究,該免疫策略研