肺炎鏈球菌溶血素粘膜免疫保護(hù)效果的研究.pdf

1、目的：
　　 肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae,S.pn)是引起嚴(yán)重侵襲性感染和上呼吸道感染最重要的病原體之一,WHO估計(jì)全球每年約有160萬人死于肺炎鏈球菌引起的各種疾病,約100萬病例為5歲以下兒童,而90％以上的死亡病例在發(fā)展中國家;隨著耐藥菌株的不斷出現(xiàn),肺炎鏈球菌感染的治療面臨越來越多的問題,有效的疫苗成為預(yù)防其感染的一個重要手段。
　　 目前,免疫途徑的選擇正在成為疫苗開發(fā)需要考慮

2、的問題,與傳統(tǒng)的肌肉注射免疫方式相比,粘膜免疫在產(chǎn)生局部免疫反應(yīng)的同時,還可以刺激系統(tǒng)性免疫反應(yīng),對許多感染性疾病的防御都起重要作用,因此,WHO將粘膜免疫定為兒科疫苗發(fā)展的方向。
　　 溶血素(Pneumolysin,Ply)為肺炎鏈球菌的重要毒素之一,幾乎存在于所有血清型的S.pn中,具有很好的保守性,最新研究報道顯示,Ply在菌體表面存在表達(dá)。但是,由于Ply具有細(xì)胞毒性,必須對其優(yōu)化。本課題組前期研究表明,第146位丙氨

3、基酸缺失后可以導(dǎo)致Ply毒力和溶血活性完全喪失,并能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生保護(hù)性抗體,因此,突變的Ply是肺炎鏈球菌良好的疫苗候選蛋白,本課題擬研究△A146 Ply粘膜免疫對肺炎鏈球菌感染的保護(hù)作用。
　　 方法：
　　 利用重組蛋白原核表達(dá)技術(shù)對第146位氨基酸缺失的Ply蛋白(△A146 Ply)進(jìn)行體外表達(dá),重組蛋白經(jīng)粘膜途徑免疫BALB/C小鼠,制備△A146 ply特異性抗血清。SDS-PAGE及Western blo

4、t分析目的蛋白的表達(dá)及在六株常見致病性肺炎鏈球菌中的保守性,間接ELISA檢測血清及唾液中△A146 Ply特異性抗體效價,并分析其產(chǎn)生IgG的亞型,同時,無菌操作獲得免疫后小鼠脾細(xì)胞,檢測其培養(yǎng)上清中相應(yīng)的細(xì)胞因子水平。19F型S.pn鼻腔感染免疫后小鼠,取其鼻腔灌洗液和肺勻漿,鋪板計(jì)數(shù)其中定植的細(xì)菌數(shù)量;致病性肺炎鏈球菌NCTC7466,CMCC(B)31436、CMCC(B)31207及CMCC(B)31614菌株經(jīng)鼻腔感染免疫后

5、小鼠,檢測重組ply蛋白對其在小鼠鼻咽部及肺部感染的保護(hù)作用并評價其主動免疫保護(hù)效果。進(jìn)行體外抗黏附實(shí)驗(yàn),檢測△A146 Ply蛋白及其抗血清是否對肺炎鏈球菌R6黏附A549細(xì)胞具有抑制作用。
　　 結(jié)果：
　　 包含肺炎鏈球菌pry(146位氨基酸突變)序列的重組工程菌BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)得到大量以可溶形式表達(dá)的重組蛋白,經(jīng)Ni-NTA親和層析純化,SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)得到了純度＞95%的純化蛋白。We

6、stern blot檢測發(fā)現(xiàn),Ply在六株常見的致病性肺炎鏈球菌NCTC7466,TIGR4,CMCC(B)31436、CMCC(B)31207,CMCC(B)31614及CMCC(B)31693中具有很好的保守性。重組蛋白經(jīng)粘膜免疫BALB/C小鼠,檢測其血清及唾液中特異性抗體發(fā)現(xiàn),血清中△A146Ply特異性IgG效價高達(dá)5.12×105,唾液中IgG及IgA效價分別達(dá)到4.0×103和4.8×103;利用Santa公司羊抗鼠IgG

7、1,IgG2a,IgG2b,IgG3二抗亞型檢測免疫后血清中IgG亞型,結(jié)果顯示,重組蛋白△A146 Ply粘膜免疫BALB/C小鼠主要刺激宿主產(chǎn)生IgG1,和IgG2b為主,提示宿主產(chǎn)生的免疫反應(yīng)主要為Th2型。檢測免疫后小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中相應(yīng)細(xì)胞因子水平發(fā)現(xiàn),△A146 Ply粘膜免疫后刺激宿主產(chǎn)生了高水平的IL-17A,劑量高達(dá)678.55±189(pg/ml),峰值出現(xiàn)于刺激后48小時。CMCC(B)31693抗定植實(shí)驗(yàn)顯示,

8、△A146 Ply粘膜免疫后肺炎鏈球菌在小鼠鼻咽部及肺部的定植降低10-20倍(p＜0.05)。致病性肺炎鏈球菌NCTC7466,CMCC(B)31436、CMCC(B)31207及CMCC(B)31614菌株經(jīng)鼻腔感染免疫后小鼠,檢測其在小鼠鼻咽部及肺部的細(xì)菌數(shù)量發(fā)現(xiàn),肺炎鏈球菌CMCC(B)31436及CMCC(B)31614在小鼠鼻咽部的定植降低20倍左右(p＜0.05),肺炎鏈球菌NCTC7466,CMCC(B)314367及C

9、MCC(B)31614在小鼠肺內(nèi)的定植降低20-30倍(p＜0.05)。主動免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示,重組蛋白△A146 Ply粘膜免疫可以有效延長小鼠生存時間,提高其生存率,其對肺炎鏈球菌NCTC7466,CMCC(B)31436、CMCC(B)31614及CMCC(B)31207的保護(hù)率分別為50%,41.7%,50%,41.7%。體外抗黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,△A146 Ply特異性抗血清100倍、500倍、2500倍和10000倍稀釋時,對肺

10、炎鏈球菌R6對黏附A549細(xì)胞的抑制率分別為65%、60%、55%和35%;重組△A146 Ply蛋白在1μg/ml,10μg/ml,20μg/ml,50μg/ml時對肺炎鏈球菌R6黏附A549細(xì)胞的抑制率分別為15%、20%、25%和30%。
　　 結(jié)論：
　　 上述結(jié)果提示,△A146 Ply蛋白經(jīng)粘膜免疫BALB/C小鼠可有效降低肺炎鏈球菌在宿主鼻咽部和肺部的定植,其保護(hù)作用可能依賴于高水平的IgA抗體及IL-17