肺炎鏈球菌ZmpB蛋白疫苗的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae，S.pn)作為最重要的人類病原菌之一能夠引起危及生命的侵襲性疾病，尤其是在老人和小孩中。其造成的死亡在美國及歐洲是所有能夠用疫苗預(yù)防疾病中最高的，而在世界范圍內(nèi)絕大多數(shù)的死亡是發(fā)生在發(fā)展中國家。由于耐藥問題的愈發(fā)嚴(yán)重，疫苗已經(jīng)成為防治S.pn的重點。
　　 鋅金屬蛋白酶(Zinc metalloprotease B，ZmpB)存在于所有分離出的肺

2、炎鏈球菌中[15]，其作為一個毒力因子能夠誘導(dǎo)下呼吸道腫瘤壞死因子α(TNF-α)的產(chǎn)生。用基因展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)ZmpB的抗原位點能夠與77％的成人血清反應(yīng)，高于PspA的60%。這些結(jié)果提示ZmpB可能是肺炎鏈球菌一個良好的新疫苗靶點。肺炎鏈球菌DnaJ(HSP40)作為熱休克蛋白之一，具有高度的保守性，用粘膜以及腹腔免疫后均能夠抵御多種肺炎鏈球菌的攻擊。肺炎鏈球菌溶血素(Ply)是近年來廣泛研究的候選疫苗蛋白，其無溶血活性突變體ΔA14

3、6 Ply能針對肺炎鏈球菌感染產(chǎn)生良好的保護作用。
　　 本文擬在評價ZmpB作為疫苗候選蛋白的潛力的基礎(chǔ)上，進一步研究其與DnaJ、Ply聯(lián)合后的保護效果。
　　 方法：
　　 在大腸桿菌中進行克隆和表達(dá)ZmpB重組蛋白(保守區(qū)段)，免疫BALB/C小鼠得到抗ZmpB的多克隆抗體。通過Western blot鑒定ZmpB在不同肺炎鏈球菌菌株中的表達(dá)情況；評價ZmpB蛋白以及抗ZmpB多抗對于S.pn介導(dǎo)的A54

4、9細(xì)胞粘附的影響；ELISA方法檢測免疫后血清中的抗體亞型以及脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子分泌情況。對ZmpB、DnaJ、ΔA146 Ply單個蛋白粘膜免疫后小鼠用不同菌株進行定植實驗以及生存率的評價。并對ZmpB、DnaJ、ΔA146 Ply單一或聯(lián)合通過腹腔途徑免疫小鼠，通過鼻腔和腹腔兩種攻毒方式分別評價其抵擋S.pn定植和抵抗S.pn引起敗血癥感染的能力，并利用各組特異性的抗血清進行被動免疫保護實驗的評價。
　　 結(jié)果：

5、>　　 本研究成功表達(dá)了包含成熟ZmpB蛋白15到590氨基酸的多肽，其純度＞90%。Western Blot鑒定發(fā)現(xiàn)抗ZmpB多克隆抗體能夠與2型，3型，6B，14以及19F型的肺炎鏈球菌裂解物反應(yīng)，其反應(yīng)區(qū)帶大約在210Kda(ZmpB全長蛋白分子量)處。無論是ZmpB的重組蛋白還是抗ZmpB的多抗都能夠有效抑制肺炎鏈球菌與A549細(xì)胞的粘附作用。粘膜免疫ZmpB后能夠刺激小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生高水平的IL-10、IFN-γ和IL-17A

6、，并刺激小鼠產(chǎn)生以IgG1為主抗體亞型；并能夠顯著降低19F以及14型肺炎鏈球菌在肺部的定植，提高2型，3型，6B以及14型菌攻毒后小鼠的生存時間。用重組ZmpB與DnaJ和ΔA146 Ply進行聯(lián)合的腹腔免疫，與單個蛋白免疫相比能夠顯著提高對肺炎鏈球菌感染的保護力(p＜0.05)；被動免疫實驗同樣證明了用這三種蛋白聯(lián)合免疫后得到的高免疫狀態(tài)的抗血清得到的保護效果好于單個抗血清(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 Zm