鼻咽癌細(xì)胞Syk啟動子去甲基化對基因表達(dá)及侵襲轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、目的：
　　 研究鼻咽癌細(xì)胞株經(jīng)去甲基化藥物5-雜氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，5-aza-CdR)處理后，其脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，Syk)啟動子甲基化水平的變化情況，以及鼻咽癌細(xì)胞株Syk基因mRNA、蛋白表達(dá)及鼻咽癌5-8F細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的變化情況。
　　 方法：
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理
　　 選擇高分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE

2、-1、低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2、低分化成瘤高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞5-8F和永生化非癌性人鼻咽上皮細(xì)胞株NP-69進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后在培養(yǎng)液中加入5-aza-CdR，經(jīng)5-aza-CdR處理后的細(xì)胞株作為處理組，未經(jīng)5-aza-CdR處理的細(xì)胞株作為對照組。
　　 2、重亞硫酸氫鹽測序PCR(bisulfite sequencing PCR，BS-PCR)檢測Syk基因啟動子甲基化狀態(tài)
　　 提取細(xì)胞總DNA，利用B

3、S-PCR檢測經(jīng)5-aza-CdR處理前后CNE-1、CNE-2、5-8F和NP-69細(xì)胞的Syk啟動子甲基化程度的變化情況。
　　 3、實(shí)時熒光定量PCR(quantitative real time fluorescence polymerase chain reaction，Q-RT-PCR)檢測Syk mRNA的表達(dá)
　　 提取細(xì)胞總RNA，利用Q-RT-PCR檢測5-aza-CdR對CNE-1、CNE-2、5-

4、8F和NP-69細(xì)胞的Syk mRNA表達(dá)的影響。
　　 4、Western blot檢測Syk蛋白的表達(dá)
　　 提取細(xì)胞蛋白，利用Western blot檢測5-aza-CdR處理前后CNE-1、CNE-2、5-8F和NP-69細(xì)胞Syk蛋白表達(dá)的變化情況。
　　 5、Transwell細(xì)胞體外侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)檢測5-8F細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力
　　 利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測經(jīng)不用濃度5-aza-CdR處

5、理后5-8F細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)。
　　 6、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS17軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、5-aza-CdR處理前后CNE-1、CNE-2、5-8F和NP-69細(xì)胞的Syk啟動子甲基化程度
　　 對照組和處理組細(xì)胞的Syk基因啟動子甲基化率CNE-1分別為31.2％±1.2％和16.8％±2.3

6、％、CNE-2分別為52.8％±1.6％和36.4％±1.9％，5-8F分別為70.4％±2.2％和48.0％±1.9％，處理組細(xì)胞的Syk基因啟動子甲基化率與對照組相比存在顯著差異(P＜0.01)。而NP-69細(xì)胞Syk基因啟動子的甲基化在5-aza-CdR處理前后均未檢測到。
　　 2、5-aza-CdR處理前后CNE-1、CNE-2、5-8F和NP-69細(xì)胞的Syk mRNA表達(dá)水平
　　 對照組NP-69細(xì)胞的S

7、yk mRNA的表達(dá)水平按100％計算，對照組CNE-1、CNE-2和5-8F細(xì)胞的Syk mRNA的表達(dá)量分別為50.0％±1.1％、32.3％±1.4％和28.5％±1.0％，處理組CNE-1、CNE-2、5-8F和NP-69細(xì)胞的Syk mRNA的表達(dá)量分別為75.8％±2.3％、42.0％±3.1％、36.6±1.5％和99.3％±2.1％。處理組細(xì)胞SykmRNA表達(dá)量與對照組相比顯著提高(P＜0.05)，而在NP-69細(xì)胞株

8、中Syk mRNA表達(dá)量在5-aza-CdR處理前后的變化無明顯差異(P＞0.05)。另外，5-aza-CdR對提高高分化鼻咽癌細(xì)胞CNE-1的Syk mRNA表達(dá)的影響大于低分化鼻咽癌細(xì)胞CNE-2(P＜0.01)。
　　 3、5-aza-CdR處理前后CNE-1、CNE-2、5-8F和NP-69細(xì)胞的Syk蛋白表達(dá)水平對照組NP-69、CNE-1、CNE-2和5-8F細(xì)胞的Syk蛋白的表達(dá)量分別為93.7％±2.1％、43.

9、8％±1.8％、23.6％±2.3％和19.8±2.6％，處理組分別為93.5％±2.6％、65.5％±1.9％、36.2％±2.1％和32.7％±1.2％。NP-69細(xì)胞株處理組與對照組相比，Syk蛋白表達(dá)量無明顯變化(P＞0.05)，三種鼻咽癌細(xì)胞處理組與各自對照組相比，Syk蛋白表達(dá)量顯著提高(P＜0.01);5-aza-CdR對提高高分化鼻咽癌細(xì)胞CNE-1的Syk蛋白表達(dá)的影響大于低分化鼻咽癌細(xì)胞CNE-2(P＜0.01)。<

10、br>　　 4、5-aza-CdR處理前后5-8F細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)
　　 對照組侵襲細(xì)胞和轉(zhuǎn)移細(xì)胞OD值分別為0.532±0.022和0.628±0.036，經(jīng)不同濃度的5-aza-CdR處理24h后其侵襲細(xì)胞和轉(zhuǎn)移細(xì)胞OD值，1μmol/L時分別為0.461±0.031和0.542±0.029;5μmol/L時分別為0.318±0.019和0.380±0.031;10μmol/L時分別為0.101±0.026和0.143±0

11、.040。經(jīng)5-aza-CdR處理后，5-8F細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力均顯著低于對照組(P＜0.01)，且5-aza-CdR對5-8F細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的抑制作用具有劑量依賴性。
　　 結(jié)論：
　　 1、經(jīng)5-aza-CdR處理后CNE-1、CNE-2和5-8F鼻咽癌細(xì)胞株的Syk基因啟動子甲基化水平降低，5-aza-CdR能有效逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細(xì)胞株Syk基因啟動子的甲基化狀態(tài)。
　　 2、去甲基化處理使CNE-1、CNE

12、-2和5-8F鼻咽癌細(xì)胞株因甲基化沉默的Syk基因恢復(fù)表達(dá)，Syk mRNA及蛋白表達(dá)升高，同時呈劑量依賴性地降低5-8F細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。
　　 3、低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2對5-aza-CdR敏感性低于高分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1，經(jīng)藥物處理后，高分化的鼻咽癌細(xì)胞株恢復(fù)Syk基因表達(dá)的比率較低分化的鼻咽癌細(xì)胞株高。
　　 4、5-aza-CdR在逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細(xì)胞Syk基因啟動子甲基化恢復(fù)其表達(dá)的同時，其本身存在