矮牽牛與煙草單重瓣相關(guān)基因的表達(dá)分析及酵母單雜交文庫(kù)的建立.pdf

1、矮牽牛，作為研究花發(fā)育的模式植物，近幾年關(guān)于其花發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子研究多不勝數(shù)，這些花發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子主要集中于MADS-box家族。擬南芥中大多數(shù)MADS-box家族基因的功能都已被揭示，尤其是C類基因AG，很早就被研究發(fā)現(xiàn)它的缺失表達(dá)能夠造成雄蕊的瓣化，以及花器官分生組織的無(wú)限增生，最終在植物花上表現(xiàn)出重瓣的表型。
　　 在矮牽牛中，我們同樣發(fā)現(xiàn)它的C類基因PMADS3干涉載體的轉(zhuǎn)化可以使野生煙草花獲得重瓣表型。為了探索PMAD

2、S3基因調(diào)控花單重瓣發(fā)育的具體途徑，我們以實(shí)驗(yàn)室姐妹交保存的自然界的單重瓣矮牽牛和野生型煙草、轉(zhuǎn)基因的重瓣煙草作為材料，分別利用基因芯片、抑制消減雜交以及實(shí)時(shí)定量PCR這三種技術(shù)篩選鑒定了這兩類植株中同源的差異表達(dá)基因，并初步認(rèn)為這些基因?yàn)镻MADS3調(diào)控花單重瓣發(fā)育途徑上的調(diào)控因子。另外，為了進(jìn)一步完善PMADS3調(diào)控花單重瓣發(fā)育的具體途徑，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了酵母單雜交文庫(kù)以用來(lái)研究這些調(diào)控因子之間的上下游關(guān)系以及發(fā)掘這條途徑上其他的調(diào)控因

3、子。具體內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1)利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)已知的NCBI上的煙草18個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和矮牽牛33個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在單重瓣植株之間的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，分別在這兩種植株中篩選了15個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，并對(duì)這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了聚類，同源性較高且表達(dá)變化趨勢(shì)一致的轉(zhuǎn)錄因子則被我們假設(shè)為PMADS3調(diào)控花單重瓣發(fā)育的途徑上的作用因子。我們最后獲得了4對(duì)同源轉(zhuǎn)錄因子，分別是:FBP20與tobmads1，PMADS3與NtMADS3，

4、FBP6與NtFBP6，PMADS12與SEP。除去PMADS3基因外，我們推測(cè)其他三對(duì)同源基因都參與了PMADS3的調(diào)控途徑。
　　 2)分析矮牽牛和煙草基因芯片的數(shù)據(jù)結(jié)果，我們將其中l(wèi)og值大于2的所有差異基因分上調(diào)和下調(diào)兩類聚類在一起;處理抑制消減雜交技術(shù)獲得的矮牽牛和煙草差異表達(dá)基因，將重瓣植株中特異表達(dá)的基因定義為表達(dá)量上調(diào)，而單瓣植株中特異表達(dá)的基因定義為表達(dá)量下調(diào)，也分上調(diào)和下調(diào)兩類聚類，并與基因芯片的結(jié)果整合在一

5、起，我們可以發(fā)現(xiàn)許多矮牽牛中差異表達(dá)的基因與煙草同源，并且差異變化趨勢(shì)一致。
　　 3)進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)基因芯片和抑制消減雜交獲得的同源差異基因進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)相對(duì)定量PCR結(jié)果分析后可以挑出3對(duì)差異同源基因，并且都表現(xiàn)出表達(dá)量下調(diào)的現(xiàn)象。我們推測(cè)這3對(duì)基因可能是PMADS3基因控制花單重瓣發(fā)育中的調(diào)控因子。
　　 4)為了對(duì)篩選到的3對(duì)轉(zhuǎn)錄因子和3對(duì)差異結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)一步確定它們之間的作用關(guān)系以及發(fā)掘