外源性S100A8-A9誘導(dǎo)人食管鱗癌細(xì)胞EC9706凋亡及機制研究.pdf

1、背景與目的:
　　食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)在我國是最常見的上消化道惡性腫瘤，尤其在河南省，發(fā)病率和死亡率都很高。ESCC發(fā)生是多基因、多因素、多階段相互作用的結(jié)果，在分子水平涉及多基因及蛋白質(zhì)的變異，但其確切發(fā)病機制尚不清楚，阻礙了該病的有效防治。因此，探索ESCC的發(fā)生機制，對有效預(yù)防ESCC的發(fā)生，降低發(fā)病率和死亡率顯得尤為重要。
　　目前認(rèn)為，食管

2、炎可能是ESCC發(fā)生的癌前病變條件之一，S100A8和S100A9在多種腫瘤細(xì)胞和浸潤的免疫細(xì)胞中均有表達(dá)，具有類似致炎細(xì)胞因子的功能，其作用機制十分復(fù)雜。S100A8/A9是S100A8和S100A9以鈣離子依賴方式形成的異源二聚體，在細(xì)胞內(nèi)、外發(fā)揮多種生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)S100A8/A9在多種腫瘤中高表達(dá)，并可發(fā)揮抗腫瘤和促腫瘤雙重效應(yīng)。但另有研究顯示S100A8/A9在食管鱗癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)或缺失。提示其在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中

3、的作用有別于其他腫瘤，但其機制尚不清楚。
　　本研究在確定食管鱗癌細(xì)胞EC9706不表達(dá)S100A8和S100A9的前提下，探討EC9706細(xì)胞中是否表達(dá)RAGE(receptor of advanced glycation end)和TLR4(Toll-like receptor4)受體，外源性S100A8/A9是否與細(xì)胞內(nèi)源性RAGE或TLR4受體結(jié)合，以及外源性S100A8/A9對EC9706細(xì)胞凋亡的影響及其調(diào)控機制，為進(jìn)

4、一步研究S100A8/A9相關(guān)的食管鱗癌新的治療靶點提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.培養(yǎng)人食管鱗癌細(xì)胞EC9706，分為三組:(1) Blank組:加入轉(zhuǎn)染試劑GenJetTM的空白對照;(2)NC組:轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載質(zhì)粒的陰性對照;(3)實驗組:瞬時共轉(zhuǎn)染S100A8和S100A9真核載體。轉(zhuǎn)染細(xì)胞放置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。
　　2.轉(zhuǎn)染24h后用抗體將S100A8和S100A9

5、蛋白染色，熒光顯微鏡估算轉(zhuǎn)染效率。
　　3.通過光學(xué)顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h的NC組和實驗組細(xì)胞生長狀況，估算細(xì)胞減少量。
　　4.TUNEL法檢測觀察外源性S100A8/A9對EC9706細(xì)胞凋亡的影響。
　　5.細(xì)胞免疫熒光染色后，通過共聚焦顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染48h時RAGE(receptor ofadvanced glycation end)和TLR4(Toll-like receptor4)的表達(dá)，并

6、觀察S100A8/A9與RAGE和TLR4受體的共定位表達(dá)情況。
　　6.Q RT-PCR法檢測瞬時轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h EC9706細(xì)胞中s100a8和s100a9的mRNA的表達(dá)水平，同時檢測Erk1/2、Nf-κb p65的mRNA的表達(dá)水平，及下游靶基因Bcl-2和p53的mRNA表達(dá)水平。
　　7.Western blot檢測瞬時轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h EC9706細(xì)胞中S100A8和S100A9蛋白

7、的表達(dá)，ERK1、ERK2和NF-κB P65蛋白的表達(dá)，及下游靶基因Bcl-2和P53蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.在人食管鱗癌EC9706細(xì)胞中，S100A8和S100A9的表達(dá)缺失。
　　2.熒光顯微鏡估算轉(zhuǎn)染效率約為65％。
　　3.光學(xué)顯微鏡觀測結(jié)果表明:實驗組的細(xì)胞數(shù)量隨著轉(zhuǎn)染時間的增加逐漸減少，實驗組細(xì)胞減少量約60％，而NC組細(xì)胞減少量約10％。
　　4.TUNEL實驗結(jié)果表明:與NC組

8、相比，實驗組細(xì)胞隨時間增加細(xì)胞凋亡程度隨之加劇，凋亡的細(xì)胞數(shù)目明顯增多(P＜0.05)。
　　5.共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，RAGE和TLR4受體在Blank組、NC組和實驗組細(xì)胞中均有表達(dá)，且在實驗組細(xì)胞內(nèi)外源性S100A8/A9與RAGE及TLR4均有共定位。
　　6.QRT-PCR檢測結(jié)果顯示:s100a8和s100a9 mRNA僅在實驗組表達(dá)。與NC組和Blank組相比，實驗組Erk1/2、Nf-κb p65和p53 m

9、RNA表達(dá)量表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);實驗組Bcl-2 mRNA表達(dá)量的表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)。
　　7.Western blot結(jié)果表明:S100A8和S100A9蛋白僅在實驗組表達(dá)。與NC組和Blank組相比，實驗組ERK1、 ERK2、NF-κB P65及P53蛋白表達(dá)量隨著轉(zhuǎn)染時間的增加顯著增加(P＜0.05);而Bcl-2在實驗組的表達(dá)隨著轉(zhuǎn)染時間的增加顯著降低(P＜0.05)。
　　結(jié)