葉黃素對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)分化效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的 惡性腫瘤已成為人類死亡的主要原因之一，每年全世界約有700萬人死于癌癥。食管癌(esophageal cancer，EC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)生在食管上皮細(xì)胞，其發(fā)病較隱匿、進(jìn)展快、預(yù)后差，具有顯著的地域性分布差異。在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率位于惡性腫瘤的第六位，在中國則位于第四位。我國是世界上食管癌的高發(fā)國家，世界上709﹪左右的食管癌發(fā)生在我國，是目前世界上死亡率最高的國家之一。積極預(yù)防及治療食管癌對(duì)于提高

2、人民的健康水平及促進(jìn)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有重要的意義。雖然經(jīng)過多年的基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐，食管癌患者的生存率并沒有得到根本的改善，EC仍嚴(yán)重威脅著人民的生命和健康。因此，尋找行之有效的干擾食管癌發(fā)生和發(fā)展的線索和物質(zhì)成為廣大學(xué)者關(guān)注的重要課題。流行病學(xué)資料顯示，不良飲食為食管癌的誘因之一，并且現(xiàn)已證明人們所攝取的食物中有促癌成分也有抗癌成分，因此尋找食物中的抗癌成份進(jìn)行食管癌的預(yù)防及治療具有十分重要的意義。食管癌患者常常伴有免疫功能低下，加上

3、手術(shù)創(chuàng)傷等，術(shù)后短期往往不能耐受毒性較大的化療藥物的應(yīng)用。因此，食管癌術(shù)后患者應(yīng)該應(yīng)用一些性質(zhì)較溫和的既具有抗癌作用又能提高免疫功能的藥物。目前，眾多學(xué)者主要著眼于從天然產(chǎn)物中尋找新的化學(xué)藥物。 植物化學(xué)物為植物性食物中天然存在的、含量較少的一類具有抗突變、抗癌或其它生理活性的化學(xué)物質(zhì)。近年來對(duì)其的研究成為食品化學(xué)/營養(yǎng)學(xué)在抗腫瘤方面研究的熱點(diǎn)。葉黃素(lutein)是一種天然植物提取物，屬于含氧類胡蘿卜素。國外大量的流行病學(xué)

4、證據(jù)表明，葉黃素在預(yù)防視黃斑退化、阻斷腫瘤、心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面都有著廣泛的生物學(xué)活性。在我國，葉黃素的應(yīng)用僅僅局限于飼料行業(yè)，其生物學(xué)活性和生物學(xué)效應(yīng)研究尚未引起食品和醫(yī)藥行業(yè)的重視。國內(nèi)學(xué)者王明臣等研究證實(shí)lutein具有明顯的抗氧化、抗衰老和抗突變等生物學(xué)效應(yīng)。本課題擬在前期研究的基礎(chǔ)上，以人食管癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞作為研究對(duì)象，利用生化及分子生物學(xué)技術(shù)，旨在探討lutein對(duì)EC9706細(xì)胞的增殖抑制

5、和誘導(dǎo)分化效應(yīng)及其分子機(jī)制，期望為食管癌的干預(yù)阻斷防治提供新的線索和途徑。 材料與方法 1．常規(guī)培養(yǎng)人食管癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞，測(cè)定并繪制該細(xì)胞株的生長曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2．MTT比色法測(cè)定EC9706細(xì)胞的增殖活性，用不同濃度葉黃素作用EC9706細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。 3．HE染色法觀察葉黃素作用后EC9706細(xì)胞形態(tài)的改變。 4．酸解DNA甲綠-派朗寧染色并計(jì)數(shù)經(jīng)葉黃素作用食管癌分化

6、細(xì)胞／增殖細(xì)胞的比例，觀察葉黃素對(duì)EC9706細(xì)胞分化的影響。 5．采用流式細(xì)胞法測(cè)定葉黃素作用EC9706細(xì)胞后細(xì)胞周期的改變及凋亡情況；免疫組織化學(xué)法測(cè)定葉黃素對(duì)EC9706細(xì)胞Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)的影響，以及葉黃素對(duì)EC9706細(xì)胞周期素Cyclin D1與Cyclin E蛋白表達(dá)的影響。 6．所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。多組問的比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩

7、兩比較用LSD檢驗(yàn)，率的比較采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05差異具有顯著性。 結(jié)果 一、葉黃素對(duì)人食管癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞增殖的抑制作用 1．葉黃素對(duì)EC9706細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變 1.1倒置顯微鏡下活細(xì)胞觀察：葉黃素高濃度組細(xì)胞濃度下降，除部分細(xì)胞體積縮小，胞漿胞核濃縮外，多數(shù)細(xì)胞變形，呈現(xiàn)梭形改變。隨葉黃素濃度及作用時(shí)間的增加，細(xì)胞毒性改變更趨明顯。 1.2 HE染色光學(xué)顯微觀察：鏡下觀察可見陰

8、性對(duì)照組EC9706細(xì)胞較圓，核顯藍(lán)紫色深染，胞漿淡藍(lán)紫色，細(xì)胞核大，胞漿少，胞核比增大，呈現(xiàn)典型惡性腫瘤細(xì)胞特征；而葉黃素處理組細(xì)胞多呈橢圓形或不規(guī)則形，大部分核深染程度較輕，胞漿多且淡染，呈淺紫紅色，細(xì)胞核小，核漿比增大，個(gè)別發(fā)生空泡變性。細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，呈現(xiàn)梭形細(xì)胞等上皮細(xì)胞形態(tài)，提示葉黃素誘導(dǎo)其成熟分化，細(xì)胞惡性程度降低。 2.葉黃素對(duì)EC9706細(xì)胞生長曲線的影響陰性對(duì)照組食管癌細(xì)胞的生長曲線隨著時(shí)間的延長呈現(xiàn)

9、顯著的上升趨勢(shì)。而不同濃度葉黃素組處理EC9706細(xì)胞一定時(shí)間后細(xì)胞的生長曲線均明顯低于陰性對(duì)照組(P<0.05)，呈現(xiàn)一定的劑量和時(shí)間依賴性。其中80μg/ml和160μg/ml葉黃素組96h食管癌細(xì)胞的存活率分別為57.77﹪和45.57﹪。 3.葉黃素對(duì)EC9706細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)的影響與陰性對(duì)照組相比，葉黃素作用EC9706細(xì)胞96h后，各劑量組的細(xì)胞增殖指數(shù)明顯降低(P<0.05)，并呈時(shí)間和劑量依賴性。

10、二、葉黃素對(duì)人食管癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用葉黃素干預(yù)處理EC9706細(xì)胞72、96h后，酸解DNA甲綠-派朗寧染色顯示，和陰性對(duì)照組相比，葉黃素組增殖型細(xì)胞明顯降低(P<0.05)，并且增殖型細(xì)胞/分化型細(xì)胞的比值隨著葉黃素濃度的升高而降低。 三、葉黃素對(duì)人食管癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞周期阻滯作用 1.葉黃素作用后EC9706細(xì)胞周期的改變從細(xì)胞周期各時(shí)相分布來看，經(jīng)葉黃素各組作用后，G<,0>/G<,1>

11、期細(xì)胞比例明顯增多，而S期細(xì)胞比例逐漸減少，G<,2>/M期細(xì)胞分布比例也有減少的趨勢(shì)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示葉黃素各組對(duì)EC9706細(xì)胞系的細(xì)胞周期均有明顯影響(P<0.05)。 2．葉黃素作用后EC9706細(xì)胞周期素Cyclin D1與Cyclin E的表達(dá)葉黃素處理EC9706細(xì)胞96h后，經(jīng)過免疫組化測(cè)定，食管癌細(xì)胞Cyclin D1蛋白表達(dá)降低，而陰性對(duì)照組表達(dá)水平較高，兩者相比差異具有顯著性(P<0.05)；Cyclin

12、E蛋白在陰性對(duì)照組食管癌細(xì)胞中表達(dá)水平較高，經(jīng)葉黃素干擾處理的EC9706細(xì)胞中Cyclin E表達(dá)明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性意義(P<0.01)。 四、葉黃素對(duì)人食管癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用 1．DNA倍體分析葉黃素作用后EC9706細(xì)胞96h后，葉黃素組：EC9706細(xì)胞在流式細(xì)胞儀DNA直方圖上可見明顯的亞二倍峰體(凋亡峰，Ap)，而陰性對(duì)照組在二倍體峰前見微量亞二倍體峰。 2．葉黃素作用

13、后EC9706細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)中葉黃素處理組與陰性對(duì)照組Bcl-和Bax蛋白均有表達(dá)，96h后，對(duì)照組Bcl-2蛋白表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量多，顏色深，呈強(qiáng)表達(dá)，而葉黃素處理組陽性細(xì)胞表達(dá)色澤淺，呈弱表達(dá)，對(duì)照組與葉黃素處理組差異有顯著性(P<0.05)，表明葉黃素可以下調(diào)食管癌EC9706細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)。而正常對(duì)照組少數(shù)細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)且色澤淺，呈弱表達(dá)，葉黃素組表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量多，顏色深，呈強(qiáng)表達(dá)，對(duì)照組與葉黃素

14、處理組有顯著性差異(P<0.05)，揭示葉黃素誘導(dǎo)EC9706細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)。 結(jié)論 1．MTT試驗(yàn)結(jié)果提示葉黃素在體外具有抑制人食管癌細(xì)胞株EC9706增殖的作用，且具有時(shí)間劑量依賴性。 2．HE染色以及酸解DNA甲綠—派朗寧染色顯微鏡下觀察提示葉黃素可以誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞分化。 3．流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，葉黃素可以明顯干預(yù)人食管癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞的增殖周期，將EC9706細(xì)胞