shRNA對(duì)食管鱗癌EC9706細(xì)胞p70S6K1表達(dá)的影響.pdf

1、食管鱗癌是我國(guó)北方最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一,尤其是河南省林縣發(fā)病率最高。手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療以及生物治療為主的綜合治療,使食管癌治療有了較快的發(fā)展。但是,食管鱗癌發(fā)生的確切機(jī)理仍然不清楚。因此,如何提高食管鱗癌的早期診斷率,以及抗腫瘤藥物的開發(fā)仍然是個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。
　　 70 kDa核糖體S6激酶1(70 kDa ribosomal S6 kinase1,p70S6K1)是哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian t

2、arget of rapamycin,mTOR)的一個(gè)重要的下游靶蛋白,能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、周期進(jìn)展和存活。在細(xì)胞信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著復(fù)雜的作用。當(dāng)前研究的熱點(diǎn)主要是mTOR抑制劑,現(xiàn)在有多種mTOR抑制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn),并取得了初步成效。mTOR抑制劑也能夠改變腫瘤的放化療敏感性。而針對(duì)p70S6K1的阻斷策略的研究還很少,且p70S6K1的活化水平與mTOR抑制劑的敏感性的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。
　　 因此,本課題試圖構(gòu)

3、建p70S6K1特異性抑制的短發(fā)夾RNA(short hairpinRNA,shRNA)表達(dá)載體,并檢測(cè)其對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞(Esophageal squamouscell careinoma cell,ESCCC)株EC9706細(xì)胞p70S6K1 mRNA和磷酸化p70S6K1(phosphated p70S6K1,p-p70S6K1)蛋白表達(dá)的影響,而能夠選擇出干擾效果較好的p70S6K1特異性shRNA表達(dá)載體,為進(jìn)一步研究p7

4、0S6K1在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能提供有效地工具。
　　 方法:
　　 1、shRNA表達(dá)載體構(gòu)建
　　 根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則,在Ambion公司網(wǎng)站設(shè)計(jì)并選取3個(gè)p70S6K1特異性靶序列,而設(shè)計(jì)合成正反義DNA片段,3’端添加5個(gè)T,作為RNA聚合酶Ⅲ的終止子,兩端加酶切位點(diǎn)。合成的正反義65 nt寡核苷酸鏈經(jīng)退火形成雙鏈DNA(double strand DNA,dsDNA),并與線性的pSIREN-Retr

5、oQ-DsRed-Express載體連接,得到重組質(zhì)粒,分別命名為p1shRNA-p70S6K1、p2shRNA-p70S6K1和p3shRNA-p70S6K1。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌,在氨芐抗性培養(yǎng)基中37℃過(guò)夜培養(yǎng),挑取陽(yáng)性克隆,送菌液測(cè)序鑒定。
　　 2、轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞
　　 根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書步驟,將重組質(zhì)粒p1 shRNA-p70S6K1轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分兩組①對(duì)照

6、組(無(wú)質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染):②實(shí)驗(yàn)組(質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組)；轉(zhuǎn)染24 h時(shí)在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光表達(dá)。
　　 3、RT-PCR
　　 應(yīng)用RT-PCR實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24、48、72、96和120 h p70S6K1 mRNA表達(dá)的變化情況,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
　　 4、Western blotting
　　 采用Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24、48、72、96和120 h p-p70S6K1表

7、達(dá)的變化情況,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
　　 5、圖像處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 使用圖像處理軟件IPP5.0.2對(duì)RT-PCR和Western blotting實(shí)驗(yàn)圖片進(jìn)行灰度值分析。應(yīng)用SPSS10.0軟件,采用單因素方差分析方法(one-way ANOVA),P值<0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用最小有意義差異(least significant difference,LSD)t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較,P值<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　

8、　 結(jié)果:
　　 1、重組質(zhì)粒的鑒定通過(guò)測(cè)序鑒定,報(bào)告顯:pSIREN-RetroQ-DsRed-Express載體連接序列與設(shè)計(jì)序列完全相符。
　　 2、熒光表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞24 h后,在熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光表達(dá)。
　　 3、RT-PCR結(jié)果與對(duì)照組相比,p70S6K1 mRNA表達(dá)在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和72 h下調(diào)(P值均<0.05),其中,在轉(zhuǎn)染48 h達(dá)到最大抑制率,最大干擾

9、效率為55.3％。
　　 4、Western blotting結(jié)果與對(duì)照組相比,p-p70S6K1(Th389)表達(dá)在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h和96 h下調(diào)(P值均<0.05),其中,在轉(zhuǎn)染48 h達(dá)到最大抑制率,最大干擾效率約為58.0％。
　　 討論:
　　 本研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建p70S6K1特異性干擾載體。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)初步證實(shí):所構(gòu)建得p70S6K1特異性shRNA表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞株