PTEN反義寡核苷酸對食管癌EC9706和EC-1細胞增殖、凋亡影響的研究.pdf

1、食管癌是常見的一種惡性腫瘤。我國是該疾病的高發(fā)區(qū),對其進行有效的治療成為當前的重要任務之一,但目前尚缺乏對包括此疾病在內(nèi)的惡性腫瘤進行有效治療,尋找包括食管癌在內(nèi)惡性腫瘤的有效治療方法成為當今研究的熱點。
　　 研究發(fā)現(xiàn),PI3k/Akt/mTOR信號通路在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過程中具有重要作用。參與細胞凋亡、轉(zhuǎn)錄、翻譯、代謝、血管新生以及細胞周期的調(diào)控,并且影響著這些細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。
　　 第10號染色體缺失的磷酸酶

2、和張力蛋白同源基因(phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten,PTEN)是一抑癌基因,在PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導通路中,PTEN起著“分子開關(guān)”的作用,為PI3K/Akt/PTEN/mTOR信號轉(zhuǎn)導通路的主要負性調(diào)節(jié)因子。
　　 反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASODN)可特異性的抑制靶基因的表達但不影響其他基

3、因的正常功能,近年來已廣泛用于基因研究,但在食管癌EC9706和EC-1細胞中,利用反義寡核苷酸抑制PTEN的功能后對PI3k/Akt/mTOR信號通路中的各因子會產(chǎn)生怎樣的影響,目前尚未見文獻報道。
　　 該實驗采用反義寡核苷酸技術(shù)抑制高分化食管癌EC9706和低分化EC-1細胞PTEN的表達,觀察濃度為3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L的PTEN ASODN處理食管癌EC9706和EC-1細胞24h、48h、7

4、2h后對食管癌細胞增殖、凋亡的影響及PI3K/Akt/mTOR信號通路中PTEN、mTOR、4EBP1、S6K1的表達情況,并比較PTEN ASODN對不同分化程度的食管癌EC9706和EC-1細胞的作用效果,為食管癌的臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 1.高分化的人食管癌EC9706細胞中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所贈送,低分化的EC-1細胞香港大學曹世華教授贈送。
　　 2.食管癌EC9706和EC

5、-1細胞的分組培養(yǎng):將細胞種于3個96孔板和3個24孔板,每板分6組,即:終濃度為3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L的ASODN實驗組,終濃度為12μmol/L的SODN對照組組、終濃度為12μmol/L的N-ODN對照組和細胞對照組(不進行轉(zhuǎn)染),每組設3個復孔進行培養(yǎng)。
　　 3.利用Lipofecter脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染PTEN ASODN于EC9706和EC-1細胞中。
　　 4.運用MTT法測各實驗組

6、和對照組細胞的相對增殖率。
　　 5.運用TUNEL檢測實驗組和對照組細胞的凋亡。
　　 6.利用流式細胞儀測各實驗組和對照組細胞增殖周期。
　　 7.采用免疫細胞化學檢測各實驗組和對照組細胞PTEN、mTOR、4EBP1、S6K1蛋白的表達。
　　 8.采用原位雜交檢測各實驗組和對照組細胞PTEN、mTOR的mRNA表達。
　　 9.免疫細胞化學和原位雜交結(jié)果判定:每張滴爬片標本高倍鏡下觀察10

7、個視野,采用十三點評分法,即以0～4分來判定陽性細胞的百分比:0分沒有陽性細胞；1分,陽性細胞<10％；2分,10％<陽性細胞<50％；3分,50％<陽性細胞<80％；4分,陽性細胞>80％；根據(jù)無、弱、中、強的染色強度分別計為0-3分；以兩個指標的乘積為最終評分。得分多的,表達強。
　　 10.根據(jù)各指標檢測結(jié)果與其對照組比較的相對變化率來判定轉(zhuǎn)染PTEN ASODN對EC9706和EC-1作用效果。
　　 11.統(tǒng)計

8、學處理:統(tǒng)計分析采用SPSS10.0軟件。計量資料用均數(shù)±標準差((X)±S)表示,兩組均數(shù)的比較用t檢驗,兩組以上均數(shù)的比較用單因素方差分析,方差不齊時先進行變量轉(zhuǎn)換,α=0.05為顯著性標準。相關(guān)性檢驗采用線性相關(guān)分析,-1≤r<0為負相關(guān)。
　　 結(jié)果：
　　 1.MTT法測細胞的相對增殖率轉(zhuǎn)染PTEN ASODN后EC9706和EC-1細胞的相對增殖率在3個濃度和3個時間段內(nèi)均隨其增加明顯增加,在同一時間不同濃度

9、和同一濃度不同時間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),濃度為12μmol/L PTEN ASODN作用72h效應最強;
　　 2.TUNEL檢測細胞的凋亡結(jié)果轉(zhuǎn)染 PTEN ASODN后細胞凋亡指數(shù)隨濃度和時間增加明顯降低,在同一時間不同濃度和同一濃度不同時間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),濃度為12μmol/L PTEN ASODN作用72h效應最強；
　　 3.流式細胞儀測各實驗組和對照組細胞增殖周期。轉(zhuǎn)染PTE

10、N ASODN于EC9706和EC-1細胞后隨濃度或時間的增加增殖指數(shù)增大。在同一時間不同濃度和同一濃度不同時間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),濃度為12μmol/L PTENASODN作用72h效應最強;
　　 4.免疫細胞化學結(jié)果轉(zhuǎn)染PTEN ASODN于EC9706和EC-1細胞后隨濃度或時間的增加mTOR、S6K1蛋白的表達增強,PTEN、4EBP1蛋白的表達降低；在同一時間不同濃度和同一濃度不同時間差異均有統(tǒng)計學意

11、義(P<0.05),濃度為12μmol/L PTEN ASODN作用72h效應最強;
　　 5.原位雜交結(jié)果轉(zhuǎn)染PTEN ASODN于EC9706和EC-1細胞后隨濃度或時間的增加PTEN mRNA表達降低而mTOR mRNA表達增強,在同一時間不同濃度和同一濃度不同時間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),濃度為12μmol/L PTENASODN作用72h效應最強;
　　 6.轉(zhuǎn)染PTEN ASODN后對EC9706和

12、EC-1細胞作用情況的比較轉(zhuǎn)染PTEN ASODN于EC9706和EC-1細胞后,各指標檢測結(jié)果與其對照組比較的相對變化率顯示,EC9706中各檢測指標的相對變化率均大于EC-1細胞,差異有顯著性(P<0.05)。提示,轉(zhuǎn)染PTEN ASODN后對EC9706細胞的作用好于EC-1細胞。
　　 7.轉(zhuǎn)染PTEN ASODN后對EC9706和EC-1細胞中PTEN與mTOR的相關(guān)性檢驗結(jié)果顯示,mTOR與PTEN呈負相關(guān)(P<0.

13、05,EC9706:-1　　 結(jié)論：
　　 1.PTEN ASODN對食管癌EC9706和EC-1細胞的增殖有促進作用,對其凋亡有抑制作用。提示PTEN具有抑制增殖、促進凋亡的作用。
　　 2.PTEN ASODN在食管癌EC9706和EC-1細胞中,PTEN4、EBP1表達降低,mTOR、S6K1表達增強。提示PTEN可使mTOR、S6K1表達降低,使4EBP1表達增強