柴胡皂甙抗實驗性癲癇的藥效學及其作用機制研究.pdf

1、一、目的與意義 癲癇(epilepsy)是一種古老的世界性疾病，我國流行病學調(diào)查結果顯示癲癇的患病率為7.0％0，活動型癲癇的患病率為4.6％0，我國約有900萬人罹患癲癇，其中600萬人每年都有發(fā)作。由于社會傳統(tǒng)的偏見，癲癇病人及家屬常隱瞞或否認自己的病情，并承受很大的心理壓力，由癲癇引起的醫(yī)療、家庭和社會問題也不容忽視。 目前控制癲癇仍以化學藥物為主，常用的一線抗癲癇藥(AEDs)可使70％～80％各類型的癲癇患者發(fā)

2、作得以控制，但長期應用安全性較差，對于一些難治性癲癇可選擇外科手術治療，但受到適應癥的限制，風險大，費用昂貴，還存在復發(fā)的可能，因此難治性癲癇目前仍然以藥物治療為主要手段，這就需要使用新的抗癲癇藥物。如何發(fā)揮中醫(yī)藥抗癲癇的作用就成了擺在我們面前的課題，而單味中藥的活性成分研究不但能明確其抗癲癇的機制，更有利于促進中醫(yī)藥現(xiàn)代化。 近年來癲癇的發(fā)病機制研究有了長足進步。神經(jīng)元興奮性增高和高度同步化發(fā)放是癲癇發(fā)病的兩個重要特征已得到公

3、認，國內(nèi)外很多學者試圖從多個方面來探索引起神經(jīng)元興奮性增加和高度同步化發(fā)放的形成機制，提出了不少有益的見解，其中對星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)突觸信號傳遞的認識逐漸深入。位于突觸聯(lián)合處的星形膠質(zhì)細胞被認為是突觸三聯(lián)復合體的重要組成部分，當神經(jīng)系統(tǒng)損傷時星形膠質(zhì)細胞可由常態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉磻孕切文z質(zhì)細胞，其組織學特征表現(xiàn)為星形膠質(zhì)細胞的肥大和增生，生化標志則是星形膠質(zhì)細胞內(nèi)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)含量的增加，GFAP為星形膠質(zhì)細胞的特異性標記物，GF

4、AP的高表達，在某種程度上提示星形膠質(zhì)細胞的蛋白合成和運輸?shù)裙δ芑顒犹幱谝环N活躍的狀態(tài)，是星形膠質(zhì)細胞激活的標志之一。另外，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)在腦內(nèi)的異常變化，以及二者的平衡失調(diào)與癲癇的發(fā)生密切相關，而γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)是腦內(nèi)一對重要的抑制性和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)誘發(fā)癲癇最敏感的腦區(qū)，人們常選擇其作為研究癲癇的靶區(qū)。 中藥柴胡性苦、微寒，屬辛涼解表藥，歸肝、膽經(jīng)，有疏散退熱、疏

5、肝解郁、升陽舉陷之功。近年來國內(nèi)外對柴胡的藥學、藥理學及臨床應用進行了廣泛的研究。柴胡的主要成分含有皂甙、揮發(fā)油、有機酸、甾醇類、黃酮類、多糖等，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、促進皮質(zhì)酮分泌、抑制Na+-K+-ATP酶等作用，可抗腫瘤，對消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等均有作用，柴胡或以柴胡為君藥的復方在臨床上被廣泛應用。 導師陳寶田教授多年來運用“柴胡疏肝湯”治療難治性癲癇，取得了肯定的療效，動物實驗也提示“柴胡疏肝湯”能抑制戊四氮慢性

6、點燃大鼠的癇性發(fā)作，并能抑制鼠大腦皮層和海馬c-fos的表達，提高bcl-2/bax的比值，從而減少大鼠海馬和額葉的神經(jīng)細胞凋亡。前期我們研究了該方中君藥“柴胡”及柴胡皂甙的抗實驗性癲癇作用，發(fā)現(xiàn)柴胡具有明顯的鎮(zhèn)靜和抗驚厥作用，柴胡皂甙具有抗青霉素致癇作用。為了進一步研究柴胡總皂甙抗癲癇的效應及可能的作用機制，并期望闡明柴胡總皂甙中何種單體成分具有抗實驗性癲癇的作用，擬進行柴胡總皂甙對PTZ慢性點燃大鼠癇性發(fā)作及其抗最大電驚厥的影響，并

7、運用免疫組化技術探討柴胡總皂甙對慢性點燃大鼠海馬內(nèi)星形膠質(zhì)細胞GFAP的表達及GABA、Glu陽性細胞表達的影響，為篩選良好的抗癲癇中藥有效成分提供必要的理論及實驗依據(jù)。 二、方法與內(nèi)容 1.柴胡總皂甙對小鼠最大電驚厥的影響 最大電驚厥(MES)是國際上通用的癲癇大發(fā)作動物模型，由于用電刺激誘發(fā)的小鼠后肢強直性伸展可被抗癲癇藥(AEDS)阻斷或抑制，該方法常被用于篩選治療癲癇強直—陣攣發(fā)作的藥物。Merritt和

8、Putnam就曾用MES技術篩選發(fā)現(xiàn)了苯妥英鈉(PHT)，其他還有卡馬西平(CBZ)、苯巴比妥(PB)等也由MES法初選。可見MES驚厥是研究癲癇大發(fā)作的重要模型之一。 在MES模型中采用100V、2Hz單次刺激方式，以小鼠后肢強直性伸直為指標，觀察柴胡總皂甙高、中、低三個劑量組對小鼠MES的作用，記錄小鼠驚厥數(shù)和驚厥率，并與苯巴比妥鈉組、生理鹽水組相比較。 2.柴胡總皂甙對PTZ慢性點燃大鼠癇性發(fā)作及腦電圖的影響

9、 在PTZ慢性點燃模型中將48只健康SD大鼠隨機均分為6組，即空白組(A組)、生理鹽水組(B組)、丙戊酸鈉(VPA)組(C組)和柴胡總皂甙高、中、低三個劑量組(D組、E組、F組)，除空白組不做處理外，其他各組采用腹腔注射PTZ32.5mg/kg進行慢性點燃造模，造模同時給予以上不同處理因素，連續(xù)4周，每日記錄大鼠癇性發(fā)作級別及次數(shù)，最后描記大鼠腦電圖。 3.柴胡總皂甙抗PTZ慢性點燃大鼠癇性發(fā)作的機制研究 柴胡總皂甙對

10、PTZ慢性點燃大鼠海馬GFAP、GABA、Glu的影響：按常規(guī)灌注后取腦組織切片進行GFAP、GABA、Glu免疫組化染色，從陽性細胞數(shù)、陽性細胞灰度值及截面積等分析結果。 4.柴胡皂甙a、c、d對MES驚厥小鼠的影響 在明確柴胡總皂甙的抗實驗性癲癇作用后，采用最大電休克發(fā)作(MES)導致小鼠驚厥模型，通過記錄小鼠驚厥數(shù)和驚厥率的變化，研究三種主要的柴胡皂甙單體柴胡皂甙a、柴胡皂甙c、柴胡皂甙d(SSa、SSc、SSd)

11、抗小鼠MES驚厥作用，以期篩選有效單體成分。仍采用100V、2Hz單次刺激方式，觀察SSa高、中、低三個劑量組、SSc中劑量組、SSd中劑量組對小鼠MES的作用，并與苯巴比妥鈉組、生理鹽水組相比較。 5.柴胡皂甙a對PTZ誘導小鼠癇性發(fā)作的影響 對采用MES模型篩選的有效單體成分柴胡皂甙a(SSa)，進行抗化學致癇作用的研究，探討SSa高、中、低三個劑量組對PTZ誘導小鼠急性癲癇模型作用，通過記錄小鼠癇性發(fā)作潛伏期和強直

12、性驚厥率的變化，研究SSa對PTZ致小鼠急性癲癇模型的癇性發(fā)作的影響，并與丙戊酸鈉組、生理鹽水組相比較。 6.動態(tài)觀察柴胡皂甙a對實驗性癲癇小鼠癇性發(fā)作的影響 在柴胡皂甙a有效劑量研究基礎上，繼續(xù)對柴胡皂甙a抗實驗性癲癇的作用時間特點進行探討。研究采用PTZ誘導小鼠急性癲癇模型，通過記錄不同時間點(30min、60min、90，min、120min)對小鼠癇性發(fā)作潛伏期和強直性驚厥率的變化，研究SSa對PTZ致小鼠急性癲

13、癇模型的癇性發(fā)作影響的動態(tài)特征，并與丙戊酸鈉組對照。 三、結論 1.柴胡總皂甙具有較好的抗小鼠MES驚厥作用，并可拮抗PTZ慢性點燃大鼠的癇性發(fā)作，有一定的對抗PTZ慢性點燃作用。 2.柴胡總皂甙可以抑制PTZ慢性點燃大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞GFAP的過度表達，能較好地抑制慢性點燃大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞的異常激活，這可能是其抗PTZ慢性點燃效應的作用途徑之一。 3.柴胡總皂甙可以抑制PTZ慢性點燃大鼠海馬谷氨酸

14、陽性細胞表達，對PTZ慢性點燃大鼠海馬區(qū)GABA陽性細胞的表達也有抑制作用，并與柴胡總皂甙存在一定量效關系。柴胡總皂甙對慢性點燃大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)谷氨酸和GABA變化的影響，可能與柴胡總皂甙抗PTZ慢性點燃效應有密切聯(lián)系。 4.在柴胡總皂甙的主要單體成分中(研究SSa、SSc、SSd)，以柴胡皂甙a的抗小鼠MES驚厥效應最明顯，而SSc、SSd抗小鼠MES驚厥作用不顯著。進一步研究發(fā)現(xiàn)SSa也能對抗PTZ誘導小鼠的癇性發(fā)作，對小鼠