水稻雄性不育基因MIL3的圖位克隆與功能研究.pdf

1、雄性不育遺傳系統(tǒng)對(duì)于保持物種遺傳多樣性，增加物種對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)性具有重要意義，是作物雜種優(yōu)勢(shì)利用的生物學(xué)基礎(chǔ)，也是研究核基因與細(xì)胞質(zhì)基因互作的重要遺傳模型。花藥是影響花粉發(fā)育的重要器官，對(duì)雄性不育系花藥結(jié)構(gòu)和發(fā)育的研究有助于探索花粉敗育的原因，對(duì)深入認(rèn)識(shí)植物的雄性不育機(jī)理有很大幫助。
　　本研究所用的材料是60Coγ射線輻射誘變水稻中釉3037獲得突變體mil3。與野生型相比，mil3突變體在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段觀察不到任何明顯的異常且

2、雌配子發(fā)育正常，但是最終卻無(wú)法產(chǎn)生花粉，說(shuō)明該突變體雄配子的發(fā)育受到了影響。主要研究結(jié)果如下:
　　1.MIL3基因的定位:以純合的雄性不育突變體mil3為母本和Balilla進(jìn)行雜交，以其F2群體（150株隱性個(gè)體）為定位群體，利用F2群體150株突變表型個(gè)體將該突變基因初步定位在STS標(biāo)記S2和S3之間。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步擴(kuò)大突變體mil3和Balilla的雜交后代群體，以F3分離群體中的300株突變表型個(gè)體進(jìn)行目的基因精

3、細(xì)定位。我們又發(fā)展了9個(gè)新的STS分子標(biāo)記，最終將該基因精細(xì)定位于STS標(biāo)記S10和標(biāo)記S11之間。這兩個(gè)標(biāo)記之間的物理距離約為40kb，該區(qū)間內(nèi)包含9個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF，Open readingframe)。對(duì)這9個(gè)ORF進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中8個(gè)候選ORF在突變體中的序列都與野生型的一致，只有一個(gè)ORF的第496位核苷酸處有單堿基的插入，第497和499位核苷酸處有單堿基突變，導(dǎo)致該位點(diǎn)之后的氨基酸序列發(fā)生變化。初步確定該基因

4、為候選基基因，它是一個(gè)氧化還原酶相關(guān)基因。利用qPCR對(duì)MIL3基因的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)該基因在花藥發(fā)育后期表達(dá)量最高。
　　2.功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn):利用3'RACE-PCR和5'RACE-PCR，我們得到了MIL3基因的全長(zhǎng)序列。再將該基因的DNA片段（包含有起始密碼子ATG上游，終止密碼子TGA下游以及其ORF序列）通過(guò)BamHI酶切位點(diǎn)構(gòu)建在植物表達(dá)載體pCAMBIA1300上，獲得互補(bǔ)載體pC3-HB，并與其相應(yīng)的空載體pC3-H

5、BC轉(zhuǎn)化雜合體植株的愈傷組織中，通過(guò)對(duì)其分化形成植株的基因型鑒定和表型分析，最終表明MIL3基因突變導(dǎo)致mil3突變體的表型。
　　3.mil3突變體的花藥發(fā)育異常導(dǎo)致小孢子降解:通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)mil3突變體花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程正常。新鮮花藥的觀察實(shí)驗(yàn)表明盡管野生型和突變體的小孢子體積都逐漸變大且存在萌發(fā)孔，但突變體中的小孢子從四分體形成之后一直處于皺縮的狀態(tài)。利用花藥的橫向半薄樹(shù)脂切片來(lái)探究mil3的花藥出現(xiàn)突變表型的具體時(shí)期

6、，發(fā)現(xiàn)突變體中的小孢子能夠正常地從四分體內(nèi)釋放出來(lái)。隨著小孢子的釋放，突變體中絨氈層卻出現(xiàn)異常的膨脹，而同時(shí)期野生型花藥絨氈層逐漸被消化，后期突變體中大部分小孢子降解導(dǎo)致無(wú)花粉產(chǎn)生。
　　5.MIL3的缺陷對(duì)上下游基因表達(dá)的影響:利用qPCR對(duì)MIL3基因的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)該基因在花藥發(fā)育后期表達(dá)量最高。對(duì)影響絨氈層發(fā)育的五個(gè)基因MSP1，UDT1，TDR，DTC1和OsCP1的qPCR分析結(jié)果表明MIL3可能位于MSP1，UDT