水稻雄性不育基因MIL3的圖位克隆與功能研究.pdf

1、雄性不育遺傳系統(tǒng)對于保持物種遺傳多樣性，增加物種對環(huán)境變化的適應性具有重要意義，是作物雜種優(yōu)勢利用的生物學基礎，也是研究核基因與細胞質(zhì)基因互作的重要遺傳模型?；ㄋ幨怯绊懟ǚ郯l(fā)育的重要器官，對雄性不育系花藥結構和發(fā)育的研究有助于探索花粉敗育的原因，對深入認識植物的雄性不育機理有很大幫助。
　　本研究所用的材料是60Coγ射線輻射誘變水稻中釉3037獲得突變體mil3。與野生型相比，mil3突變體在營養(yǎng)生長階段觀察不到任何明顯的異常且

2、雌配子發(fā)育正常，但是最終卻無法產(chǎn)生花粉，說明該突變體雄配子的發(fā)育受到了影響。主要研究結果如下:
　　1.MIL3基因的定位:以純合的雄性不育突變體mil3為母本和Balilla進行雜交，以其F2群體（150株隱性個體）為定位群體，利用F2群體150株突變表型個體將該突變基因初步定位在STS標記S2和S3之間。在此基礎上，我們進一步擴大突變體mil3和Balilla的雜交后代群體，以F3分離群體中的300株突變表型個體進行目的基因精

3、細定位。我們又發(fā)展了9個新的STS分子標記，最終將該基因精細定位于STS標記S10和標記S11之間。這兩個標記之間的物理距離約為40kb，該區(qū)間內(nèi)包含9個開放閱讀框(ORF，Open readingframe)。對這9個ORF進行測序分析，結果發(fā)現(xiàn)其中8個候選ORF在突變體中的序列都與野生型的一致，只有一個ORF的第496位核苷酸處有單堿基的插入，第497和499位核苷酸處有單堿基突變，導致該位點之后的氨基酸序列發(fā)生變化。初步確定該基因

4、為候選基基因，它是一個氧化還原酶相關基因。利用qPCR對MIL3基因的表達模式分析發(fā)現(xiàn)該基因在花藥發(fā)育后期表達量最高。
　　2.功能互補實驗:利用3'RACE-PCR和5'RACE-PCR，我們得到了MIL3基因的全長序列。再將該基因的DNA片段（包含有起始密碼子ATG上游，終止密碼子TGA下游以及其ORF序列）通過BamHI酶切位點構建在植物表達載體pCAMBIA1300上，獲得互補載體pC3-HB，并與其相應的空載體pC3-H

5、BC轉化雜合體植株的愈傷組織中，通過對其分化形成植株的基因型鑒定和表型分析，最終表明MIL3基因突變導致mil3突變體的表型。
　　3.mil3突變體的花藥發(fā)育異常導致小孢子降解:通過觀察發(fā)現(xiàn)mil3突變體花粉母細胞的減數(shù)分裂過程正常。新鮮花藥的觀察實驗表明盡管野生型和突變體的小孢子體積都逐漸變大且存在萌發(fā)孔，但突變體中的小孢子從四分體形成之后一直處于皺縮的狀態(tài)。利用花藥的橫向半薄樹脂切片來探究mil3的花藥出現(xiàn)突變表型的具體時期

6、，發(fā)現(xiàn)突變體中的小孢子能夠正常地從四分體內(nèi)釋放出來。隨著小孢子的釋放，突變體中絨氈層卻出現(xiàn)異常的膨脹，而同時期野生型花藥絨氈層逐漸被消化，后期突變體中大部分小孢子降解導致無花粉產(chǎn)生。
　　5.MIL3的缺陷對上下游基因表達的影響:利用qPCR對MIL3基因的表達模式分析發(fā)現(xiàn)該基因在花藥發(fā)育后期表達量最高。對影響絨氈層發(fā)育的五個基因MSP1，UDT1，TDR，DTC1和OsCP1的qPCR分析結果表明MIL3可能位于MSP1，UDT