肺癌中REIC表達(dá)的臨床病理意義及作用機(jī)理.pdf

1、肺癌是一種發(fā)病率、死亡率極高的惡性腫瘤。有資料顯示，2000年以來我國的肺癌發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)，目前我國每年肺癌死亡人數(shù)可達(dá)60萬，已成為嚴(yán)重危害人民健康的疾病。在過去的幾年中，已經(jīng)證實(shí)肺癌的發(fā)生、發(fā)展是多基因改變的結(jié)果。肺癌中特殊基因的表達(dá)異常在不同的細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用，但是其發(fā)生和演進(jìn)的具體機(jī)制尚不完全清楚。
　　 REIC(Reduced Expression in Immortalized Cells)是通過差異分

2、析系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的，因?yàn)榕c對(duì)應(yīng)正常細(xì)胞相比其在永生化細(xì)胞中表達(dá)降低而得名。初步研究表明，惡性腫瘤中REIC通過參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡平衡而在腫瘤發(fā)生和演進(jìn)過程中發(fā)揮抑制作用。因此，探討REIC基因在肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義，可以推動(dòng)肺癌病因?qū)W和治療學(xué)發(fā)展。我們開展本研究，為了更好的了解REIC在肺癌發(fā)生和演進(jìn)過程中的作用，進(jìn)而促進(jìn)對(duì)肺癌的診斷和治療。
　　 材料與方法：
　　 1、培養(yǎng)肺癌細(xì)胞，利用RT-PCR和實(shí)時(shí)

3、PCR檢測(cè)各種細(xì)胞系中的REICmRNA水平，ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各種肺癌細(xì)胞REIC蛋白的血清分泌水平。
　　 2、MTT比色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)REIC重組蛋白對(duì)肺癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖情況的影響，篩選REIC重組蛋白的最佳作用濃度；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(Flow CytoMetry，F(xiàn)CM)檢測(cè)REIC重組蛋白作用后SQ-5和KJ細(xì)胞周期變化及細(xì)胞凋亡情況；REIC重組蛋白作用后，應(yīng)用Cldu/Idu雙重標(biāo)記法檢測(cè)SQ-5細(xì)胞的復(fù)制

4、時(shí)相。
　　 3、提取肺癌細(xì)胞中的基因組DNA，進(jìn)行啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)。并在培養(yǎng)液中加入5-乙酰唑胺-2-脫氧胞苷酸進(jìn)行甲基化干擾。同時(shí)利用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)干擾前后細(xì)胞的REICmRNA水平。
　　 4、應(yīng)用RT-PCR、實(shí)時(shí)PCR和Western-blot檢測(cè)18例肺癌新鮮標(biāo)本REIC mRNA水平和蛋白表達(dá)：構(gòu)建組織芯片后免疫組織化學(xué)檢測(cè)肺癌中REIC蛋白表達(dá)，比較其表達(dá)與肺癌臨床病理生物學(xué)行為及預(yù)后的關(guān)系。
　　

5、 結(jié)果：
　　 1、肺癌細(xì)胞系中REIC表達(dá)及分泌水平
　　 H460、H446、MS-1、AOI、LC-IF、SQ-5、KJ及PC-14等八種肺癌細(xì)胞中REIC mRNA表達(dá)水平和分泌水平很低。
　　 2、重組REIC蛋白對(duì)肺癌細(xì)胞表型和血管內(nèi)皮細(xì)胞表型的影響
　　 加入不同濃度REIC重組蛋白之后，SQ-5和KJ兩種肺癌細(xì)胞的增殖率在低濃度范圍內(nèi)(＜100ng/mL)有一定程度升高，高濃度范圍內(nèi)（＞

6、100ng/mL）有降低趨勢(shì)(P＜0.05)。對(duì)ECV304和HUVEC兩種血管內(nèi)皮細(xì)胞具有同樣的作用（P＜0.01）。SQ-5和KJ兩種肺癌細(xì)胞在50ng/mL和100ng/mL的REIC重組蛋白作用下，G2期比例增加，S期比例下降（P＜0.05）；細(xì)胞早期凋亡水平提高，線粒體膜電位檢測(cè)提示細(xì)胞線粒體受損（P＜0.05）。
　　 3、提取肺癌細(xì)胞中的基因組DNA，進(jìn)行啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)
　　 甲基化實(shí)驗(yàn)顯示，H460、H

7、446、MS-1、AOI、LC-IF、SQ-5、KJ及PC-14等八種肺癌細(xì)胞中啟動(dòng)子存在甲基化。5-乙酰唑胺-2-脫氧胞苷酸處理H460、H446、SQ-5及KJ后，以上細(xì)胞啟動(dòng)子甲基化消失，REIC mRNA水平較處理前升高(P＜0.05)。
　　 4、肺癌組織中REIC表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系
　　 與癌旁組織相比，癌組織中REIC mRNA和蛋白表達(dá)水平均減少（P＜0.05）。REIC蛋白表達(dá)于肺癌細(xì)胞漿中，R

8、EIC表達(dá)與患者的性別、年齡、分化、淋巴侵襲、靜脈侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期及預(yù)后無關(guān)（P＞0.05），而與Caspase-3表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1、重組REIC蛋白對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有增殖促進(jìn)作用，對(duì)肺鱗癌和腺癌細(xì)胞同時(shí)具有增殖促進(jìn)作用和誘導(dǎo)凋亡作用。
　　 2、REIC啟動(dòng)子區(qū)甲基化是其表達(dá)降低的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　 3、肺癌組織中REIC蛋白和mRNA的組織含量低于癌