促紅素衍生肽ARA290對(duì)大鼠移植腎早期損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、隨著器官移植領(lǐng)域技術(shù)的飛速發(fā)展，腎移植成功率不斷提高，腎移植已成為治療終末期腎病(Endstagerenaldisease，ESRD)的有效方法。但臨床腎移植過(guò)程中，移植腎在切取、灌注、保存等過(guò)程中不可避免的要發(fā)生一定程度的損傷，其中缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷是最重要的，并且在早期移植腎組織活檢發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷與促炎癥狀態(tài)有關(guān)，與移植物長(zhǎng)期存活以及排斥反應(yīng)的發(fā)生有直接的關(guān)系。研究證實(shí)在I/R中，

2、核因子-κB(NF-κB)的激活起了重要的作用。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，研究顯示NF-κB廣泛參與多種炎性因子基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控，可導(dǎo)致細(xì)胞的過(guò)渡活化并誘發(fā)損傷。Sung等研究發(fā)現(xiàn)在腎臟缺血期NF-κB就被激活，并且在再灌注的15min時(shí)達(dá)到高峰，NF-κB對(duì)組織的早期的炎癥起重要作用。
　　近年的研究發(fā)現(xiàn)，促紅素(Erythropoietin，EPO)除了對(duì)造血系統(tǒng)的造血作用外，EPO在各種器官的缺血再灌注損傷中有顯著

3、的組織保護(hù)作用，包括腎、心臟、肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等，證實(shí)在缺血再灌注前后給予促紅素可起到保護(hù)作用。在腎臟中，研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用EPO可以減輕腎臟的缺血再灌注損傷，促紅素具有很好的抗炎、抗凋亡作用，并且這些保護(hù)作用是劑量依賴(lài)的，從而對(duì)腎臟起到即刻保護(hù)作用。EPO保護(hù)組織的可能的機(jī)制是通過(guò)受體與配體結(jié)合相互作用的方式來(lái)發(fā)揮其效用的。在缺血狀態(tài)下，EPO受體表達(dá)將會(huì)顯著增加。EPO在細(xì)胞內(nèi)可以有多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑。已發(fā)現(xiàn)EPO可以激活NF-κB，并且

4、目前發(fā)現(xiàn)的可能參與EPO組織保護(hù)作用的信號(hào)分子途徑有多種，如PI3/Akt，JAK2及MAPKs等均可引起NF-κB的活化，EPO的受體復(fù)合物((erythropoietinreceptro，EPO-R)包括2個(gè)經(jīng)典型的(EPOR)2和2個(gè)β型的受體βcR2(β-commonreceptor,βcR)。EPO與傳統(tǒng)的EPO同源二聚受體(EPOR)2結(jié)合能力要比具有保護(hù)性亞單位的EPOR2-βcR2的結(jié)合能力強(qiáng)，因此啟動(dòng)組織的保護(hù)作用需給

5、予更高劑量的EPO。但高劑量EPO帶來(lái)的副作用也是很明顯的，如心血管事件發(fā)生率增加、血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)增加、腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)等，因此限制了其在臨床中對(duì)保護(hù)組織的廣泛應(yīng)用。MBrines等研究發(fā)現(xiàn)在小鼠心肌細(xì)胞上存在保護(hù)性受體亞單位βcR(CD131)，能與EPO受體亞單位，EPO-R形成異源二聚受體復(fù)合物，通過(guò)激活不同的信號(hào)通路，進(jìn)而發(fā)揮減輕炎性反應(yīng)、抗細(xì)胞調(diào)亡，對(duì)組織和器官發(fā)揮保護(hù)作用，但不啟動(dòng)造血信號(hào)通路的傳導(dǎo)，因此為了避免EPO的不良反

6、應(yīng)，各種的EPO衍生物研發(fā)能獨(dú)立于促紅素的傳統(tǒng)的結(jié)合位點(diǎn)而和EPOR2-βcR2受體復(fù)合物結(jié)合發(fā)揮組織保護(hù)作用。ARA290是最新的EPO類(lèi)似物衍生肽，含有11種氨基酸序列，在空間上組成線(xiàn)性多肽，能獨(dú)立于促紅作用位點(diǎn)而發(fā)揮組織保護(hù)作用。目前有少量的研究證實(shí)，ARA290在腎、腦缺血再灌注損傷中都有很好的組織保護(hù)作用，并且沒(méi)有高劑量EPO帶來(lái)的明顯的副作用。
　　盡管上述對(duì)ARA290的研究已取得初步進(jìn)展，并且表現(xiàn)出了很好的組織保護(hù)

7、作用，但應(yīng)用ARA290預(yù)處理供體供腎并且觀察其在移植后移植腎早期損傷中的作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究擬模擬臨床腎移植條件及過(guò)程，將ARA290加入U(xiǎn)W器官保存液中，在4℃低溫保存條件下對(duì)供腎進(jìn)行預(yù)處理，并建立異體大鼠腎移植模型，觀察移植術(shù)后對(duì)腎臟的保護(hù)作用，應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測(cè)移植術(shù)后移植腎炎性因子mRNA的表達(dá)以及可能的NF-κB的信號(hào)機(jī)制，探討應(yīng)用促紅素衍生肽ARA290處理腎移植供體，提高供體質(zhì)量、減輕移植腎早期損傷，從而取

8、得臨床上較好的腎移植療效。
　　第一部分:體外部分促紅素衍生肽ARA290對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞低溫缺氧復(fù)氧損傷中的保護(hù)作用及NF-κB的機(jī)制研究
　　目的
　　觀察ARA290對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)低溫缺氧復(fù)氧損傷中的保護(hù)作用，探討ARA290預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的NF-κB機(jī)制。
　　方法
　　1.建立HUVEC細(xì)胞低溫缺氧復(fù)氧模型;并

9、隨機(jī)分為四組:①對(duì)照組(Control):10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液原代培養(yǎng)72小時(shí)后，更換不含血清的1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)10小時(shí);②缺氧/復(fù)氧組(H/R):10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液原代培養(yǎng)72小時(shí)后，更換不含血清的1640培養(yǎng)液低溫缺氧保存6h/復(fù)氧4小時(shí);③ARA290組:10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液原代培養(yǎng)72小時(shí)后，更換經(jīng)含10nmol/ml的ARA290的UW器官保存液;④UW器官保存液組(UW

10、):10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液原代培養(yǎng)72小時(shí)后，更換UW器官保存液并低溫缺氧保存6h/復(fù)氧4小時(shí)。
　　2.MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力、AnnxeniV/FITC，PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　3.用RT-PCR技術(shù)測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1、ICAM-1、P-selectin、IL-6和MCP-1的mRNA表達(dá)。
　　4.用EMSA方法測(cè)定各組低溫缺氧/復(fù)氧損傷后HUVEC細(xì)胞NF-κB結(jié)合活性。<

11、br>　　結(jié)果
　　1.Control組的細(xì)胞存活率為97.3±6.8％，而經(jīng)低溫缺氧復(fù)氧損傷后的H/R組細(xì)胞存活率明顯下降，只有71.4±5.9％，和control組比較(P＜0.01);而經(jīng)ARA290預(yù)處理組的內(nèi)皮細(xì)胞存活率略低于control組，存活率為89.5±7.1％(P＜0.05)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而顯著高于UW組和H/R組(P＜0.01)，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異。UW組內(nèi)皮細(xì)胞存活率為76.3±6.0％與H/R組無(wú)差異(P

12、＞0.05)。
　　2.細(xì)胞凋亡率H/R組13.13±0.94％、control組1.15±0.18％、ARA290組5.34±0.61％、UW組的11.45±0.71％，ARA290預(yù)處理組的細(xì)胞凋亡率，和其余三組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　3.RT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)ARA290預(yù)處理組ICAM-1、VCAM-1、IL-6、MCP-1及P-selectin的mRNA表達(dá)與H/R組相比明顯下降，分別下降了(65

13、.19±3.18)％、(71.53±5.13)％、(68.53±4.81)％、(51.09±4.17)％、(45.24±3.79)％，差異有顯著意義(P＜0.01)，而UW組各組內(nèi)皮細(xì)胞的因子mRNA表達(dá)未被抑制，略低于H/R組因子的mRNA表達(dá)，兩組間比較統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)差異(P＞0.05);H/R組上述因子mRNA表達(dá)與Control組相比，分別上升了（10.58±1.17）倍、（22.03±3.74）倍、(13.29±1.87)倍、（29

14、.13±3.15）倍、（19.15±2.18）倍，統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異(P＜0.01)。
　　4.NF-κBDNA結(jié)合活性EMSA法結(jié)果顯示:Control組有較弱的表達(dá)，RDU為1.20±0.11;H/R組RDU為58.31±5.17，與control組及ARA290組比較有顯著差異((P＜0.01)。ARA290預(yù)處理組的RDU為8.69±1.14，明顯低于UW組的RDU約為50.61±3.73，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異(P＜0.0

15、1)。同時(shí)在特異性競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)即在H/R組中，加入未標(biāo)記的特異性探針及未標(biāo)記非特異性探針SP-1競(jìng)爭(zhēng)，其RDU值分別為1.55±0.23和54.3±1.60。
　　結(jié)論
　　1.在低溫缺氧復(fù)氧損傷中，HUVEC上調(diào)了相關(guān)的趨化因子及粘附分子的mRNA表達(dá)水平。
　　2.促紅素衍生肽ARA290可對(duì)HUVEC細(xì)胞的低溫缺氧復(fù)氧損傷有保護(hù)作用，可抑制其凋亡，降低了粘附分子及趨化因子的mRNA表達(dá)水平。
　　3.促紅素衍生

16、肽ARA290預(yù)處理可抑制NF-κB的活化。
　　第二部分:在體研究促紅素衍生肽ARA290減輕大鼠移植腎早期損傷及機(jī)制研究
　　目的
　　探討應(yīng)用促紅素衍生肽ARA290預(yù)處理腎移植供體，提高供體質(zhì)量、減輕大鼠移植腎早期損傷。
　　方法
　　1.建立大鼠異體腎移植模型，將促紅素衍生肽ARA290加入U(xiǎn)W器官保存液中對(duì)供體器官進(jìn)行預(yù)處理，將大鼠隨機(jī)分為3組:每組6只:(1)Sham組（假手術(shù)組），SD大鼠開(kāi)

17、腹后，即將傷口縫合，24h后切取左腎;(2)UW組，供腎經(jīng)UW灌注及低溫缺氧保存6h，移植到受體大鼠24h后切取移植腎;(3)ARA290組供腎經(jīng)含10nmol/Kg的UW低溫缺氧保存6h，移植到受體大鼠24h后切取移植腎。
　　2.觀察ARA290對(duì)移植大鼠腎功能及腎組織形態(tài)學(xué)的保護(hù)作用。
　　3.應(yīng)用免疫組織化學(xué)法觀察炎性細(xì)胞對(duì)移植腎早期的浸潤(rùn)，并觀察ARA290對(duì)其影響。
　　4.應(yīng)用分子生物學(xué)方法RT-PCR等

18、方法檢測(cè)移植術(shù)后移植腎組織炎性因子ICAM-1、VCAM-1、MCP-1及RANTES的mRNA表達(dá)，并觀察ARA290對(duì)其影響。
　　5應(yīng)用EMSA法檢測(cè)NF-κB的DNA結(jié)合活性，探討其保護(hù)移植腎早期損傷的可能機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.ARA290組的血肌酐值為180.28±32.06μmmol/L，而UW組的為319.48±35.02μmmol/L(P＜0.01)，Sham組的為32.15±7.08μmmol/

19、L，而ARA組則明顯低于UW組(P＜0.01);同樣，ARA290組尿素氮水平明顯低于UW組(19.48±3.81vs.31.19±9.17mmol/L，P＜0.01)，而UW組則明顯高于Sham組(31.19±9.17vs.4.21±0.69mmol/L,P＜0.01)
　　2.UW組的移植腎組織受損嚴(yán)重，其主要表現(xiàn)為腎小管結(jié)構(gòu)破壞消失，上皮細(xì)胞腫脹、脫落、刷狀緣丟失，可見(jiàn)核固縮，腎小管擴(kuò)張、管腔阻塞，并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn);經(jīng)AR

20、A290預(yù)處理供體腎臟后，與UW組相比，移植腎的損傷程度則有明顯改善;
　　3.UW組可見(jiàn)大量的巨噬細(xì)胞在腎小血管間質(zhì)浸潤(rùn);而與ARA290組相比，經(jīng)ARA290處理組則在小管間質(zhì)區(qū)域偶見(jiàn)巨噬細(xì)胞，減少了的浸潤(rùn)。
　　4.與Sham組相比，UW組移植腎的MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、及RANTES的mRNA水平明顯升高(P＜0.05);與UW組和相比，經(jīng)ARA290處理的移植腎MCP-1、ICAM-1、VCAM-1

21、、及RANTES的mRNA水平顯著下降(P＜0.01)。
　　5.ARA290組NF-κB的DNA結(jié)合活性略高于Sham組（1.016±0.28VS0.54±0.30），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，與UW組相比(51.35±3.18VS1.16±0.38)，顯著抑制(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.促紅素衍生肽ARA290對(duì)大鼠移植腎具有保護(hù)作用，可顯著減輕移植腎早期的巨噬細(xì)胞在腎小管、間質(zhì)的浸潤(rùn)，減輕形態(tài)