急性腎損傷生化標(biāo)志物NGAL免疫學(xué)檢測(cè)體系及其初步臨床應(yīng)用.pdf

1、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin,NGAL)是Kjeldsen等人1993年研究中性粒細(xì)胞中92kDa的明膠酶,即MMP-9時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種新的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(又名lipocalin)。NGAL存在于中性粒細(xì)胞中的過氧化物酶陰性顆粒中,并在人體組織細(xì)胞中廣泛分布,如支氣管、胃、小腸、胰腺、腎、前列腺、胸腺等。研究表明,NGAL蛋白具有運(yùn)輸疏水性小分子、調(diào)節(jié)MMP

2、-9活性、參與體內(nèi)Fe轉(zhuǎn)運(yùn)等功能,并可能參與免疫炎癥反應(yīng)以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展,特別是腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等過程。近年研究發(fā)現(xiàn),NGAL與腎臟關(guān)系十分密切。NGAL通過介導(dǎo)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)來刺激早期原始腎臟系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腎臟上皮細(xì)胞,從而啟動(dòng)腎臟發(fā)育。此外,NGAL可以通過轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)鐵從而消除鐵在細(xì)胞內(nèi)堆積引起的細(xì)胞損傷,也可以引起白細(xì)胞凋亡減輕炎癥反應(yīng)而發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用。眾多實(shí)驗(yàn)室和臨床研究表明,腎損傷時(shí)NGAL表達(dá)明顯增高并分泌釋放入體液中。尤其是

3、尿液中的NGAL水平與腎臟損傷的程度密切相關(guān)且很早就表現(xiàn)出來,NGAL被認(rèn)為是新的早期腎損傷生化標(biāo)志物。為將NGAL轉(zhuǎn)化入臨床應(yīng)用,制備特異性NGAL抗體并建立相應(yīng)的NGAL免疫檢測(cè)方法非常重要。在本研究中,我們利用生物信息學(xué)工具分析NGAL蛋白的性質(zhì)并通過HEK293T細(xì)胞重組表達(dá)了重組人NGAL蛋白(rhNGAL)作為抗體制備的篩選原和標(biāo)準(zhǔn)品。以購(gòu)買的NGAL重組蛋白為免疫原制備出特異性NGAL單克隆抗體并建立起NGAL免疫學(xué)檢測(cè)方

4、法。在此基礎(chǔ)上以293T細(xì)胞表達(dá)的rhNGAL為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)該方法進(jìn)行全面的方法學(xué)評(píng)價(jià),最后對(duì)57例臨床標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè),初步證明本檢測(cè)方法能夠區(qū)分正常標(biāo)本和腎臟損傷標(biāo)本NGAL水平的差異。
　　主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果
　　1.pcDNA3.1/HisA-NGAL的構(gòu)建及其在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)和純化
　　通過分子生物學(xué)軟件工具的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)NGAL蛋白且具有較多的糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn),說明NGAL蛋白翻譯后修飾加工和蛋白結(jié)

5、構(gòu)比較復(fù)雜,原核表達(dá)的蛋白不易形成正確的蛋白構(gòu)象,難以獲得理想的檢測(cè)抗體。鑒于NGAL分子特點(diǎn)和前期工作經(jīng)驗(yàn),本研究利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了pcDNA3.1/HisA-NGAL真核表達(dá)載體,在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)rhNGAL并進(jìn)行純化,獲得0.18mgrhNGAL用作制備單克隆抗體篩選原和標(biāo)準(zhǔn)品,為下一步研究奠定必要的基礎(chǔ)。
　　2.抗人NGAL單克隆抗體的制備和鑒定
　　利用購(gòu)買的NGAL重組蛋白作為免疫原經(jīng)皮下多點(diǎn)注射

6、和腹腔注射途徑免疫Balb/c小鼠,經(jīng)兩次細(xì)胞融合和篩選獲得10株分泌抗NGAL的單克隆抗體細(xì)胞株,經(jīng)進(jìn)一步檢測(cè)篩選最后制備獲得4株高效特異的抗NGAL單克隆抗體。隨后利用ELISA和WB等方法對(duì)4株抗體進(jìn)行了鑒定:4株抗體亞類如下:1-F2,1-G2和4-H11是IgG1,1-H5是IgG2b。4株抗體抗原結(jié)合力強(qiáng),特異性良好,不與無關(guān)蛋白反應(yīng)。在IHC染色中4株抗體均可以與腎組織切片中天然抗原結(jié)合,陽性主要定位于腎小管上皮細(xì)胞胞漿中

7、。通過截短表達(dá)NGAL蛋白和合成B細(xì)胞表位肽的方法鑒定抗體的抗原表位,其中單克隆抗體1-H5的B細(xì)胞表位位于NGAL蛋白第20至36位氨基酸處。而其余3株抗體無法與截短的NGAL蛋白片段和表位肽反應(yīng)。本部分工作成功制備了特異性好、效價(jià)高的NGAL單克隆抗體,為下一步NGAL免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)
　　3.NGALELISA定量檢測(cè)方法建立和初步臨床應(yīng)用研究
　　本研究以第二部分制備獲得的高效特異性單克隆抗體為原料,兩

8、兩配對(duì)篩選,建立了以1-F2為捕獲抗體,酶標(biāo)1-G2為檢測(cè)抗體的雙抗體夾心ELISA方法。應(yīng)用棋盤滴定法確定ELISA體系最佳工作條件。通過方法學(xué)評(píng)價(jià)可知本方法線性范圍0~40ng/ml,靈敏度達(dá)到4.8ng/ml,平均回收率101.9％,最大批內(nèi)CV≤10.04%,最大批間CV≤9.76%。我們收集了57例臨床尿液標(biāo)本,其中24例為正常對(duì)照組,33例為腎損傷患病組。用本ELISA系統(tǒng)進(jìn)行樣本檢測(cè),患病組尿液NGAL水平明顯高于正常對(duì)照

9、組尿NGAL水平,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。隨后選取3例腎病患者尿液和1例健康體檢者尿液為抗原,1-F2和1-G2為一抗做WB分析表明腎病患者尿液標(biāo)本出現(xiàn)陽性條帶而體檢者尿液標(biāo)本為陰性,表明1-F2和1-G2單克隆抗體能夠識(shí)別體液標(biāo)本中天然抗原。本ELISA檢測(cè)體系經(jīng)方法學(xué)評(píng)價(jià),各方面參數(shù)良好,臨床小樣本檢測(cè)與臨床診斷相符,為研發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的NGAL免疫檢測(cè)試劑并以此為基礎(chǔ)發(fā)展NGAL其他靈敏快捷的相關(guān)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。