糖尿病自身抗體免疫滲濾聯(lián)檢試劑盒的研制及初步應(yīng)用.pdf

1、背景:
　　糖尿病是一種多因素引起的復(fù)雜的代謝性疾病,發(fā)病率高、危害大,其中1型糖尿病和2型糖尿病是兩個(gè)主要類型,因二者發(fā)病機(jī)制和治療措施不同,目前糖尿病防治指南規(guī)定需予區(qū)分。1型糖尿病主要是由自身免疫性破壞胰島P細(xì)胞導(dǎo)致胰島素絕對(duì)缺乏而引起,其特征之一表現(xiàn)為外周血中出現(xiàn)針對(duì)胰島卩細(xì)胞相關(guān)分子的自身抗體,這些自身抗體作為檢測(cè)標(biāo)志物,為糖尿病分型診斷提供了一個(gè)有效的解決途徑。目前臨床常用的胰島素自身抗體(IA A)、谷氨酸脫羧酶自身

2、抗體(GADA)、蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗體(IA-2 A)在1型糖尿病中的陽(yáng)性情況、持續(xù)時(shí)間和存在強(qiáng)度各具特點(diǎn),單個(gè)指標(biāo)的診斷價(jià)值尚存在缺陷。近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體8自身抗體(ZnT8A)具有較好的檢測(cè)敏感性和特異性,聯(lián)合檢測(cè)IAA、GADA、IA-2A、ZnT8A能夠使不同的自身抗體優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),綜合提高診斷效能。但常見(jiàn)的放射配體法和酶聯(lián)免疫法主要對(duì)應(yīng)單個(gè)項(xiàng)目的測(cè)定,以微孔板為反應(yīng)載體存在板間差異和孔間差異問(wèn)題,難以達(dá)到在同一條件下同時(shí)檢

3、測(cè)四項(xiàng)指標(biāo),導(dǎo)致聯(lián)合檢測(cè)成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜、差異難控制等問(wèn)題,使得該工作在臨床開展受限。
　　目的:
　　以固相膜免疫反應(yīng)原理為基礎(chǔ),建立糖尿病自身抗體斑點(diǎn)金免疫滲濾檢測(cè)法,構(gòu)建聯(lián)合檢測(cè)IAA、GADA、IA-2A、ZnT8A的血清學(xué)診斷試劑盒,使四項(xiàng)指標(biāo)能夠在同一條件下一次同時(shí)完成檢測(cè),有效減少檢測(cè)差異并提高檢測(cè)效率,為糖尿病自身抗體聯(lián)合檢測(cè)提供一種快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確高效且價(jià)廉易推廣的新途徑。
　　方法:
　

4、　制備膠體金并標(biāo)記鏈霉親和素作為顯色探針,將重組人胰島素、谷氨酸脫羧酶、蛋白酪氨酸磷酸酶和鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體8抗原點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜上,設(shè)計(jì)生物素-鏈霉親和素級(jí)聯(lián)信號(hào)放大反應(yīng)體系,探索并確定最優(yōu)檢測(cè)條件,建立糖尿病自身抗體斑點(diǎn)金免疫滲濾檢測(cè)法。將免疫滲濾裝置和配套試劑組成免疫滲濾聯(lián)檢試劑盒,初步應(yīng)用于檢測(cè)臨床病例和健康對(duì)照標(biāo)本,評(píng)估試劑盒性能。
　　結(jié)果:
　　1、自制的18nm膠體金經(jīng)透射電鏡鑒定具有良好分散性和均一性,以其成功標(biāo)記

5、鏈霉親和素并獲得高速離心純化。
　　2、篩選確定了斑點(diǎn)金免疫滲濾法檢測(cè)IAA、GADA、IA-2A、ZnT8A的最適反應(yīng)條件,構(gòu)建完成了免疫滲濾聯(lián)檢試劑盒并優(yōu)化其制備工藝。
　　3、應(yīng)用本試劑盒檢測(cè)42例 T1DM敏感性為66.7％,檢測(cè)100例健康對(duì)照特異性為97%。與E L IS A法比較在自身抗體陽(yáng)性檢出率上無(wú)顯著差異(P>0.05)。采用3個(gè)批次的試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致,4°C干燥保存10周內(nèi)檢測(cè)性能穩(wěn)定。
　　結(jié)