青光眼濾過手術(shù)對眼免疫赦免的影響及其機(jī)制的實驗研究.pdf

1、青光眼是位列世界第一位的不可逆性致盲眼病。我國非選擇性人群的原發(fā)性青光眼患病率為0.52％，致盲率為10％。青光眼治療的主要目的是降低眼壓，包括藥物治療、激光治療、手術(shù)治療，其中青光眼濾過手術(shù)仍是目前青光眼治療的主要手段之一，手術(shù)主要通過建立一條新的眼外引流途徑，將房水自前房直接或間接(通過房水引流裝置)引流至球結(jié)膜下間隙(形成濾過泡)，然后經(jīng)球結(jié)膜滲漏到淚膜或由周圍組織吸收，從而達(dá)到降低眼壓以保全視功能的目的。功能濾過泡的維持是青光眼

2、濾過手術(shù)成功的標(biāo)志之一，但濾過手術(shù)由于破壞了眼球壁生理結(jié)構(gòu)的完整性，且非生理性濾過泡隆起于眼表，故眼局部組織的結(jié)構(gòu)和功能受到一定的影響。 眼組織結(jié)構(gòu)的完整性對于維持正常視功能具有重要意義，此種組織結(jié)構(gòu)完整性有賴于多種機(jī)制，其中最重要的機(jī)制之一是眼內(nèi)免疫赦免機(jī)制，而前房相關(guān)性免疫偏離(anterior chamber-associated immune deviation，ACAID)是形成和維持眼免疫赦免狀態(tài)的核心機(jī)制。所謂AC

3、AID是指前房引入抗原(人工引入或眼內(nèi)抗原進(jìn)入)后所誘發(fā)的一種全身性免疫偏離現(xiàn)象，特征性地表現(xiàn)為遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed-type hypersensitivity，DTH)缺如及誘導(dǎo)出特異性非補(bǔ)體結(jié)合抗體和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的前體細(xì)胞，是機(jī)體防御眼部特異性和非特異性炎癥的一種重要機(jī)制。誘導(dǎo)ACAID的機(jī)制目前尚不完全清楚，但眼部的局部解剖學(xué)因素是其形成的重要因素：由于眼內(nèi)腔缺乏淋巴管引流，大部分的房水進(jìn)入眼前節(jié)的靜脈系統(tǒng)而引流吸

4、收，使前房內(nèi)抗原繞過局部淋巴結(jié)而直接進(jìn)入脾臟，脾臟取代局部淋巴結(jié)直接接受并處理抗原信息，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生ACAID特征性的抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群。目前研究表明，抗原通過小梁網(wǎng)進(jìn)入靜脈途徑并直接到達(dá)脾臟對于ACAID的誘導(dǎo)起著關(guān)鍵性作用。 與其他類型的器官移植相比，正位角膜移植成功率較高，目前認(rèn)為主要原因是移植后多數(shù)患者出現(xiàn)了ACAID；而針對高危移植受體，如果預(yù)先誘導(dǎo)針對移植抗原的ACAID則可延長移植物的存活時間。嚴(yán)重角膜病變

5、合并青光眼是一組十分難于治療的病例，一般需要進(jìn)行穿透性角膜移植術(shù)，同時及時地控制眼壓。近年來多項臨床研究顯示，青光眼引流管植入術(shù)后行角膜移植的患者中，角膜植片的排斥率顯著增高。多項對角膜移植聯(lián)合青光眼引流管植入術(shù)的術(shù)后的遠(yuǎn)期效果觀察均指出：引流管植入有效地控制了眼壓，但是引流管的存在是角膜移植的獨立危險因素，在排除了引流管的機(jī)械損傷等因素后，植片的免疫排斥率仍有所增高。 綜上所述，ACAID是機(jī)體的重要免疫赦免機(jī)制之一，對于正常

6、視功能的維持具有重要意義，是角膜移植成功率較高的主要機(jī)制，眼內(nèi)抗原大部分隨房水進(jìn)入靜脈系統(tǒng)到達(dá)脾臟而繞過局部淋巴結(jié)對其形成有重要作用。而在青光眼引流管植入患者，角膜移植排斥率顯著增高。因此，本課題正是基于上述免疫學(xué)的研究進(jìn)展，結(jié)合臨床研究結(jié)果，我們提出以下假說：青光眼濾過手術(shù)破壞了眼局部的解剖結(jié)構(gòu)，有可能使前房內(nèi)抗原與局部淋巴結(jié)接觸機(jī)會增多而破壞了ACAID的誘導(dǎo)，進(jìn)而影響了眼部的免疫赦免狀態(tài)。本課題首先建立青光眼濾過手術(shù)的動物模型；然

7、后，通過前房注射抗原進(jìn)行DTH的誘導(dǎo)和檢測，研究青光眼濾過手術(shù)是否會對ACAID的誘導(dǎo)產(chǎn)生影響；最后，通過前房注射熒光標(biāo)記抗原，檢測青光眼濾過手術(shù)后前房內(nèi)抗原引流途徑的變化，初步揭示其影響機(jī)制。 本課題的研究主要分為以下三部分：　　目的：制作大鼠青光眼濾過手術(shù)模型，對以往建立的動物模型進(jìn)行補(bǔ)充，為實驗研究提供可靠的動物模型。 方法：雄性SD大鼠10只，全麻固定后，制作以角膜緣為基底的結(jié)膜瓣，通過全鞏膜隧道穿入前房一25

8、號硅膠管，末端埋于結(jié)膜下，連續(xù)縫合結(jié)膜瓣。術(shù)后每天全麻后測雙眼眼壓，顯微鏡下觀察濾過泡形成情況；同樣方法做另外3只大鼠，分別于術(shù)后2、5、11 d做組織學(xué)檢查，觀察術(shù)后濾過泡區(qū)域組織學(xué)變化。 結(jié)果：通過大鼠前房引流管植入術(shù)，可以在結(jié)膜下形成良好的濾過泡，術(shù)眼眼壓明顯下降，組織學(xué)檢查可見明確的結(jié)膜下疏松區(qū)域，未見前房出血或引流管堵塞等并發(fā)癥，濾過泡經(jīng)過7-11 d逐漸瘢痕化。 結(jié)論：大鼠前房微管植入術(shù)是一個可靠的青光眼濾過

9、手術(shù)動物模型，經(jīng)濟(jì)實用，為下一步的研究奠定了很好的動物模型基礎(chǔ)。 目的： ACAID是眼免疫赦免的核心機(jī)制，本研究在青光眼濾過手術(shù)動物模型檢測ACAID的誘導(dǎo)情況，探討手術(shù)破壞眼局部解剖結(jié)構(gòu)對ACAID的影響，以期初步揭示濾過手術(shù)對眼免疫赦免的可能影響。 方法： 動物分為以下四組，進(jìn)行ACAID誘導(dǎo)： 第一組，ACAID陽性誘導(dǎo)組：大鼠全麻固定后，在解剖顯微鏡下將牛血清白蛋白(bovine serum a

10、lbumin，BSA)溶液(5 μl／50μg)注入前房；前房注射后第7 d于大鼠前肢皮下注射BSA(100 μg／200 μl)與等體積弗氏完全佐劑混懸液；7 d后于大鼠右耳廓皮內(nèi)注射BSA100 μg，左耳廓皮內(nèi)注射等量無菌磷酸緩沖液，24 h后檢測DTH反應(yīng)。 第二組，ACAID陰性對照組：大鼠前房內(nèi)注入無菌磷酸緩沖液，其他操作同上，作為陰性對照。 第三組，濾過手術(shù)組：行青光眼濾過手術(shù)大鼠，術(shù)后2 d觀察無前房出血

11、等并發(fā)癥，方法同(1)進(jìn)行ACAID誘導(dǎo)。 第四組，假手術(shù)組：進(jìn)行與濾過手術(shù)同樣的操作，但不形成功能性外引流，ACAID誘導(dǎo)方法同上。 結(jié)果： DTH檢測結(jié)果顯示，陽性對照組大鼠右耳廓未出現(xiàn)明顯的紅腫，其耳廓腫脹數(shù)值與陰性對照組差異明顯(P<0.001)，說明ACAID模型誘導(dǎo)成功。濾過手術(shù)組大鼠右耳廓可見明顯紅腫，其耳廓腫脹數(shù)值與陽性對照組比較有明顯差異(P<0.001)，即DTH未受抑制，說明青光眼濾過手術(shù)影響了AC

12、AID的誘導(dǎo)。而假手術(shù)組動物右耳廓未見明顯紅腫，與陽性對照組無明顯差異(P>0.05)。 結(jié)論：行青光眼濾過手術(shù)大鼠不能正常誘導(dǎo)ACAID，說明濾過手術(shù)后眼免疫赦免狀態(tài)發(fā)生了改變。而假手術(shù)組動物誘導(dǎo)ACAID能力是正常的，說明除了手術(shù)創(chuàng)傷等因素以外，前房與結(jié)膜下間隙的溝通是影響ACAID誘導(dǎo)的主要因素。 目的：擬通過研究青光眼濾過手術(shù)后前房內(nèi)抗原的引流及分布的改變，探討局部淋巴結(jié)及脾臟在其中的作用，初步揭示青光眼濾過手術(shù)

13、影響免疫赦免的機(jī)制。 方法： (1)制作頸部淋巴結(jié)切除動物模型，檢測青光眼濾過手術(shù)后ACAID誘導(dǎo)的情況。 (2)前房注射熒光標(biāo)記抗原(FITC—Dextran)，在前房注射后第1、3、5、7及12 d進(jìn)行青光眼濾過手術(shù)動物與正常動物脾臟及頸部淋巴結(jié)取材，制作冰凍切片，對熒光標(biāo)記抗原在不同組織中的分布進(jìn)行定性觀察，比較濾過手術(shù)動物與正常動物間的不同。 (3)利用流式細(xì)胞技術(shù)，檢測不同時間點脾臟、淋巴結(jié)中F

14、ITC+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的變化和不同，對前房抗原在不同組織的分布進(jìn)行定量檢測，比較濾過手術(shù)動物與正常動物組間的不同。 結(jié)果： (1)在頸部淋巴結(jié)切除動物，青光眼濾過手術(shù)后抗原特異性的DTH受到抑制，ACAID誘導(dǎo)能力恢復(fù)正常。 (2)前房注射抗原后，可觀察到熒光抗原在脾臟及淋巴結(jié)的分布，脾臟中熒光抗原主要位于脾小結(jié)的周圍，而頸部淋巴結(jié)主要位于被膜下髓竇。各時間點在脾臟和淋巴結(jié)的分布方式未見明顯不同；濾過手術(shù)動物與正常動

15、物間未見明顯不同。 (3)濾過手術(shù)大鼠，在前房注射后第1 d頸部淋巴結(jié)FITC陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(-x±SD：2.96±0.67％)明顯高于正常大鼠(1.57±0.4.8％)(P=0.001.)，而其它時間點兩組間差異不明顯。在青光眼濾過手術(shù)動物，前房注射后第5d(4.3±0.40)及第7d(2.01±0.25)脾臟FITC陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯低于正常動物(8.47±0.15，4.23±0.02)(P<0.001)。 結(jié)論：頸

16、部淋巴結(jié)在青光眼濾過手術(shù)影響眼免疫赦免中起重要的作用。對前房內(nèi)熒光標(biāo)記抗原在淋巴器官的定量研究發(fā)現(xiàn)，濾過手術(shù)動物頸部淋巴結(jié)熒光陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較正常動物顯著增高，在ACAID誘導(dǎo)的關(guān)鍵時期，脾臟陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較正常明顯降低，提示可能這兩方面都有參與其影響機(jī)制。 小結(jié)： 本課題研究發(fā)現(xiàn)，青光眼濾過手術(shù)影響了ACAID的正常誘導(dǎo)，而在假手術(shù)動物中，ACAID的誘導(dǎo)能力是正常的，說明前房與結(jié)膜下間隙的溝通是影響ACAID誘導(dǎo)的主

17、要因素。通過頸淋巴結(jié)切除動物模型中濾過手術(shù)后ACAID的檢測，發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)能力又恢復(fù)正常，說明頸部淋巴結(jié)在其影響過程中起重要作用。為了進(jìn)一步探討其影響機(jī)制，我們通過前房注射熒光標(biāo)記抗原，檢測濾過手術(shù)后前房內(nèi)抗原引流途徑的變化。研究發(fā)現(xiàn)，前房內(nèi)抗原在注射后不同時間點分布于脾臟及頸部淋巴結(jié)，定性觀察濾過手術(shù)大鼠與正常大鼠間差別不大，而進(jìn)一步通過流式細(xì)胞儀定量觀察發(fā)現(xiàn)，在正常大鼠，前房注射后第5 d到達(dá)脾臟的抗原數(shù)量有明顯的上升趨勢，而頸部淋巴