Notch4通路與LCWE誘導的冠狀動脈損傷關系的初步探討.pdf

1、目的:
　　借助于LCWE誘導的川崎病冠狀動脈炎的小鼠模型，探究Notch4信號通路在川崎病免疫性冠狀動脈炎中的作用。
　　方法:
　　干酪乳桿菌購自CICC（中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心），取對數(shù)生長期細菌用于所有實驗。
　　第一部分:LCWE誘導的冠狀動脈炎動物模型的建立
　　干酪乳桿菌首先在MRS broth中培養(yǎng)24小時，SDS過夜裂解細菌，依次加入RNase，DNase和胰酶，超聲處理破碎細胞，

2、離心取上清，使用硫酸-苯酚比色法檢測上清液中糖總量。向BALB/c小鼠腹腔注射LCWE0.5ml(處理組)和PBS0.5ml（對照組），3天、7天、14天及28天后處死小鼠，取心臟和脾臟用4％多聚甲醛中常規(guī)固定，HE染色觀察心臟和脾臟的病理變化。使用Real-time PCR技術檢測脾臟Th1/Th2細胞因子譜的變化。
　　第二部分:Notch4通路與LCWE誘導的冠狀動脈損傷關系
　　3天、7天、14天及28天摘除小鼠眼球

3、取血，先后加入cd34-eFlour66010ul， Flk-1 FITC2ul，Notch4-PE5ul，cd45-PE-Cy5.50.5ul孵育，上機檢測外周血單個核細胞中EPCs含量及其表面Notch4表達情況。設計引物GAPDH、Notch4、RBP-JK、vcam-1和P-selectin，使用Real-time PCR技術檢測胸主動脈、心肌組織Notch4、RBP-JK、vcam-1和P-selectin mRNA表達情況。

4、使用免疫組化技術檢測胸主動脈、冠狀動脈起始部vcam-1和P-selectin表達情況。
　　結果:
　　第一部分:LCWE誘導的冠狀動脈炎動物模型的建立
　　1.3天時實驗組小鼠體重明顯減輕。
　　2.心肌HE染色顯示各時間點實驗組冠狀動脈及其分支靠血管外膜處出現(xiàn)炎癥細胞浸潤。
　　3.實驗組脾臟大體觀察脾臟體積增大，重量增加，HE染色發(fā)現(xiàn)各時間點主要以脾小體增生，融合。
　　4.實驗組除IL-6外

5、，其他Th1/Th2細胞因子表達量顯著增加。
　　第二部分:Notch4和RBP-JK與冠狀動脈損傷相關
　　1.LCWE注射3天小鼠外周血循環(huán)內皮祖細胞的含量顯著高于對照組，14天時實驗組EPCs含量低于對照組;LCWE注射7天EPCs表面Notch4表達量明顯高于對照組。
　　2.14天，28天實驗組胸主動脈P-selectin mRNA和RBP-JK mRNA表達水平顯著高于對照組，P-selectin與RBP-

6、JK，Notch4與vcam-1顯著相關;心肌中P-selectin與RBP-JK顯著相關。
　　3.實驗組冠狀動脈起始部血管內皮細胞vcam-1表達除7天外，各時間點表達均不同程度升高，其中以3天組升高最為明顯;胸主動脈中段實驗組3，7天vcam-1表達高于對照組，但表達強度不及3天冠脈起始部;實驗組P-selectin冠脈起始部14天，28天表達高于對照組，胸主動脈中段14天時強于對照組。
　　結論:
　　1.循環(huán)