LCWE誘導(dǎo)小鼠冠狀動(dòng)脈炎的實(shí)驗(yàn)研究——川崎病動(dòng)物模型的建立.pdf

1、背景 川崎病(Kawasakidisease，KD)是一種常見的兒童自身免疫性血管炎綜合征，并發(fā)冠狀動(dòng)脈瘤(CAA)和冠脈狹窄是青壯年猝死和心肌梗塞發(fā)生的重要原因，新近研究表明，兒童川崎病是成人缺血性心臟病發(fā)生的新的危險(xiǎn)因素。川崎病已取代風(fēng)濕熱成為兒童后天性心臟病的主要病因。雖然靜脈輸注丙種球蛋白(IVIG)和阿斯匹林聯(lián)合治療方案廣泛應(yīng)用后，川崎病死亡率和冠狀動(dòng)脈并發(fā)癥明顯下降，但近年發(fā)現(xiàn)IVIG治療耐藥病例增多。迄今病因及發(fā)病

2、機(jī)制未明，目前認(rèn)為川崎病符合感染性疾病和自身免疫性疾病兩大特征，細(xì)菌超抗原致病是引起川崎病的重要原因，川崎病異常的免疫激活，是由細(xì)菌或病毒毒素以超抗原機(jī)制介導(dǎo)引起的。但臨床川崎病研究取材困難，國內(nèi)外目前尚缺少公認(rèn)的川崎病動(dòng)物模型用于血管炎性損傷和冠狀動(dòng)脈瘤形成的發(fā)生機(jī)制研究。本研究采用干酪乳桿菌細(xì)胞壁成分(Lactobacilluscaseicellwallextract，LCWE)注入幼年小鼠腹腔，觀察能否引致小鼠冠狀動(dòng)脈炎，旨在探討

3、建立新的川崎病動(dòng)物模型的可能性；探討LCWE的超抗原活性及其與小鼠血管免疫性損傷和冠狀動(dòng)脈炎發(fā)生的關(guān)系及作用機(jī)制。并對(duì)臨床病例進(jìn)行研究以客觀評(píng)價(jià)IVIG治療和預(yù)防川崎病冠狀動(dòng)脈病變的療效，探討IVIG療效的影響因素。 第一部分一、LCWE誘導(dǎo)小鼠川崎病冠狀動(dòng)脈炎動(dòng)物模型的建立 目的：探討干酪乳桿菌細(xì)胞壁成分誘導(dǎo)產(chǎn)生川崎病冠狀動(dòng)脈炎動(dòng)物模型的可能性。 方法：制備LCWE(1mg/ml)。將100只BALB/C小鼠隨

4、機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各50只。分別腹腔注射0.5mlLCWE和PBS。注射后1d、3d、5d、10d、和28d每組取10只小鼠分批采血、處死、留取心臟病理標(biāo)本。在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下觀察各器官組織病理變化；應(yīng)用FACSort流式細(xì)胞儀檢測小鼠CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群的百分比，計(jì)算外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群的絕對(duì)數(shù)量；采用夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法，檢測LCWE注射后3d小鼠血漿進(jìn)行TNF-α、IL-1β和IL-

5、6水平；并測量體重、心臟、脾臟重量、脾臟/體重及心臟/體重比值。 結(jié)論：LCWE單次腹腔注射能夠誘導(dǎo)BALB/C小鼠產(chǎn)生冠狀動(dòng)脈炎及心肌炎病理改變，是一種能夠可靠反映川崎病冠狀動(dòng)脈炎的良好動(dòng)物模型。其群體發(fā)病率高，病理損害與LCWE誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)有關(guān)。 二、LCWE的超抗原活性及誘導(dǎo)小鼠冠狀動(dòng)脈炎發(fā)生的超抗原機(jī)制 目的：研究超抗原LCWE激活小鼠T淋巴細(xì)胞TCRVβ的特異性，LCWE刺激表達(dá)TCRVβ2、4、6+

6、T細(xì)胞增殖的特征；研究LCWE激活小鼠T細(xì)胞CD69體內(nèi)外表達(dá)的動(dòng)力學(xué)及其作用；探討LCWE的超抗原活性與小鼠血管免疫性損傷和冠狀動(dòng)脈炎發(fā)生的關(guān)系及作用機(jī)制。 方法：①4～6周齡幼年BALB/C小鼠122只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組。按前述方法應(yīng)用LCWE建立小鼠冠狀動(dòng)脈炎動(dòng)物模型。 ②小鼠分別腹腔注射超抗原LCWE、多克隆刺激劑ConA和PBS，應(yīng)用流式細(xì)胞儀觀察超抗原刺激TCRVβ2、4、6+T細(xì)胞增殖的動(dòng)力學(xué)變化。檢

7、測CD4+CD69+T細(xì)胞表達(dá)的百分率及動(dòng)力學(xué)變化。 ③LCWE或ConA體外刺激BALB/C小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞，觀察離體條件下LCWE與小鼠TCRVβ結(jié)合的特異性；觀察LCWE5、10、15、20、25、40μg/ml或SEB2.5μg/ml或ConA溶液(1mg/ml，20μl)終濃度10μg/ml或PBS刺激下；CD4+T細(xì)胞CD69表達(dá)的陽性率及動(dòng)力學(xué)變化。 ④采用夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法，檢測血漿IL

8、-1β、IL-6和TNF-α水平。 ⑤應(yīng)用相關(guān)模型觀察TCRVβ6+CD4+T細(xì)胞增殖與T細(xì)胞活化CD69抗原表達(dá)和與血漿TNF-α水平變化的相關(guān)關(guān)系，TCRVβ6+CD4+T細(xì)胞增殖與血漿TNF-α水平變化的相關(guān)關(guān)系。 ⑥應(yīng)用Logistic回歸模型，分析冠狀動(dòng)脈炎發(fā)生與TCRVβ+T細(xì)胞增殖、與T淋巴細(xì)胞活化及與TNF-α產(chǎn)生的關(guān)系。 結(jié)論：①LCWE誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫性損傷和冠狀動(dòng)脈炎的作用是通過超抗原

9、機(jī)制實(shí)現(xiàn)的；②LCWE可直接誘導(dǎo)早期T細(xì)胞活化，具體表現(xiàn)為CD4+CD69+T細(xì)胞顯著增高；③LCWE誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子TNF-α顯著增多，該炎性因子可能是引起冠狀動(dòng)脈炎產(chǎn)生的重要機(jī)制。阻斷TNF-α的活性有可能成為川崎病治療的藥物靶點(diǎn)。 三、白三烯B4受體在免疫性血管炎發(fā)病機(jī)制中的作用 目的：研究冠狀動(dòng)脈炎模型小鼠心臟和肝臟中BLT1mRNA和BLT2mRNA的表達(dá)；模型小鼠脾臟中CD4+T細(xì)胞BLT2的表達(dá)，探

10、討LTB-BLT1、LTB-BLT2通路在小鼠冠狀動(dòng)脈炎發(fā)生中的作用。 方法：采用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)的方法，提取細(xì)胞總RNA，以O(shè)lig(dT)引導(dǎo)合成cDNA第一鏈，經(jīng)PCR擴(kuò)增，以BLT1或BLT2為引物，從心臟和肝臟組織中擴(kuò)增出BLT1mRNA或BLT2mRNA。采用凝膠圖像分析儀分析BLT1與β-actinmRNA及BLT2與β-actinmRNA的表達(dá)水平；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)間接熒光標(biāo)記檢測脾單個(gè)核細(xì)胞中

11、CD4+T細(xì)胞上BLT2的表達(dá)。采用夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法，檢測血漿IL-1β、IL-6和TNF-α水平。 結(jié)果：擴(kuò)增出分子量為430bp的BLT1mRNA和分子量為331bpBLT2mRNA。模型小鼠在注射LCWE后6h開始升高，12h達(dá)高峰，持續(xù)至3d逐漸降低，5d時(shí)回到基線；心臟和肝臟表達(dá)BLT1mRNA和BLT2mRNA，分別進(jìn)行組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)比較，注射LCWE后12小時(shí)，BLT1mRNA和BLT2mRNA的

12、光密度比值顯著升高，P＜0.05。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，在注射LCWE后1d小鼠脾臟BLT2+CD4+T細(xì)胞表達(dá)高峰，高峰時(shí)間較BLT2mRNA在心臟和肝臟的表達(dá)延遲。模型小鼠注射LCWE后3d血漿TNF-α、IL-1及IL-6水平較對(duì)照組比較明顯增高，P＜0.001。 結(jié)論：在LCWE誘導(dǎo)的小鼠免疫性損傷和冠狀動(dòng)脈炎的產(chǎn)生過程中，BLT1、BLT2在肝臟和心臟高表達(dá)；在脾單個(gè)核細(xì)胞BLT2在CD4+T細(xì)胞表達(dá)增加。LCWE能誘導(dǎo)

13、小鼠TNF-α，IL-1β，IL-6等多種炎性介質(zhì)分泌增加。因此，LTB-BLT1、LTB-BLT2通路可能在小鼠冠狀動(dòng)脈炎發(fā)生中起重要作用。 第二部分靜脈輸注丙種球蛋白防治川崎病冠狀動(dòng)脈病變的療效評(píng)價(jià) 目的：客觀評(píng)價(jià)靜脈輸注丙種球蛋白(IVIG)治療和預(yù)防川崎病(KD)冠狀動(dòng)脈病變(CAL)的療效，探討IVIG療效的影響因素。 方法：對(duì)314例KD患兒進(jìn)行回顧性對(duì)比觀察。按照治療分為阿斯匹林(ASA)+IVIG

14、組和ASA組，觀察兩組CAL發(fā)生、恢復(fù)情況、不同時(shí)機(jī)不同劑量IVIG治療KD療效，及平均住院時(shí)間、退熱時(shí)間、總熱程、血小板計(jì)數(shù)、血沉、C反應(yīng)蛋白等臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，急性期出現(xiàn)CAL者分別于病程1m，3m，6m，12m復(fù)查。 結(jié)果：ASA+IVIG組CAL發(fā)生率34.3％，ASA組56.0％，兩組比較P＜0.001。應(yīng)用IVIG2.0g/kg或1.0g/kg以及在病程3～10天應(yīng)用IVIG，CAL發(fā)生率低，P＜0.05。22.2％