Notch1通路介導染料木素拮抗對氧磷誘導的HUVECs氧化應激損傷.pdf

1、目的：
　　1.通過建立對氧磷(PO)誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）氧化應激損傷模型，初步探討 Notch1信號通路在 PO引起氧化應激損傷中的作用。
　　2.探討植物雌激素染料木素(Gen)對PO引起的HUVECs氧化應激損傷的保護作用與Notch1信號通路之間的關系。
　　方法：
　　1.PO氧化應激損傷模型建立：以不同濃度（0，300，600，900，1200，2400μM)的PO和溶媒0.1％DM

2、SO處理HUVECs24h，用試劑盒分別測定各組細胞活力(OD值)、乳酸脫氫酶（LDH）釋放量、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的含量；Western blot法檢測各組細胞中Notch1、Hes1、Bax、Caspase3和Bcl-2蛋白表達水平。觀察PO對HUVECs的氧化損傷效應的量效關系。選擇上述實驗中獲得的最佳PO刺激終濃度(1200μM)處理HUVECs不同時間（0，6，12，24h)，同上檢測各生化指標和蛋白表達

3、。觀察PO對HUVECs的氧化應激損傷的時效關系。
　　2.Gen保護HUVECs氧化應激損傷的量效、時效關系觀察：以不同濃度的Gen(0，0.05，0.1，0.5，1μM)與HUVECs共同孵育10h，再以PO（1200μM） 處理HUVECs24h。檢測各項生化指標和蛋白表達，觀察Gen保護HUVECs免受氧化應激損傷的量效關系。再以最佳濃度Gen(0.5μM)預處理HUVECs不同時間(0，6，10，14h)后，觀

4、察Gen保護HUVECs受氧化應激損傷的時效關系。
　　3.Gen抗PO氧化應激損傷作用與Notch1信號通路的關系初探：培養(yǎng)的HUVECs分為空白對照、PO刺激、PO+DAPT、DAPT處理、Gen+PO+DAPT和PO+Gen六組。以Gen(0.5μM)預處理HUVECs10h后，加Notch1特異性阻斷劑DAPT(10μM)和/或PO（1200μM）再共同培養(yǎng)24h后分別測定細胞活力、LDH、SOD和MDA含量，再次檢測各蛋

5、白的表達水平。
　　結果：
　　1.不同濃度PO處理HUVECs24h后，在顯微鏡下觀察300、600μM的PO刺激HUVECs24h后，細胞形態(tài)等均無明顯改變，1200、2400μM的PO刺激可引起細胞內(nèi)空泡與碎片增多，細胞間排列稀疏；空白組與DMSO組細胞狀態(tài)良好。CCK8分析結果顯示與空白對照組相比，不同濃度的PO（900，1200，2400μM）作用于HUVECs可劑量依賴性地導致細胞活力降低(P<0.01)。溶媒對

6、照（0.1%DMSO）與空白組相比細胞活力下降不明顯（P>0.05）。培養(yǎng)液中相關生化指標測定結果顯示，與空白對照組相比，PO(600、900、1200、2400μM）刺激可導致細胞培養(yǎng)液LDH和MDA含量顯著升高，SOD含量顯著降低（P＜0.01）。Western-blot結果顯示，與空白對照組相比，1200μM的PO可顯著上調(diào)Notch1、Hes1、Bax、Caspase3的表達（P<0.05)，同時下調(diào)Bcl-2的表達和降低Bcl

7、-2/Bax比值（P<0.05）。
　　2.采用1200μM PO刺激HUVECs不同時間（0，6，12，24h），可呈時間依賴性地降低細胞活力（P<0.05)，升高LDH和MDA含量，SOD含量顯著降低（P<0.05）。PO刺激24h可顯著上調(diào)Notch1、Hes1、Bax、Caspase3的表達（P<0.05)，下調(diào)Bcl-2的表達，降低Bcl-2/Bax比值（P<0.05)。
　　3.用Gen(0.5，1μM)預處理的

8、細胞存活率顯著升高，培養(yǎng)液中LDH和MDA含量顯著降低，SOD活性顯著升高，且在0.5μM濃度處理條件下效果最明顯（P<0.05）。與PO組相比，Gen（0.5μM）可顯著下調(diào)Notch1、Hes1、Bax、Caspase3的表達（P<0.05），上調(diào) Bcl-2表達和增加Bcl-2/Bax比值（P<0.05）。
　　4.用Gen（0.5μM）預處理HUVECs不同時間，隨著保護時間的延長細胞活力顯著上升（P<0.01)，培養(yǎng)液中

9、LDH和MDA含量顯著下降，SOD含量顯著升高（P<0.05）。Gen預處理10，14h后可顯著下調(diào)Notch1、Hes1、Caspase3、Bax的表達（P<0.05)，上調(diào)Bcl-2的表達，增加Bcl-2/Bax比值（P<0.05)，具有時間依賴性。
　　5.用Notch1通路的特異性阻斷劑DAPT(10μM)處理細胞后，與PO+Gen組相比，顯微鏡下可見P+D+G組細胞受損明顯，細胞脫落較多，細胞間隔增大。CCK8分析結果表

10、明，與空白組相比，DAPT組細胞活力無明顯變化(P>0.05)。加了PO的各組細胞活力顯著下降(P<0.05)。與PO+Gen組相比，PO+DAPT+Gen組細胞活力同樣下降（P<0.05)。酶學測定顯示，與空白對照組相比，加了PO的各組細胞培養(yǎng)液中LDH和MDA含量顯著上升，SOD含量顯著下降(P<0.05）。與Gen+PO組相比， Gen+PO+DAPT組細胞LDH和 MDA含量顯著上升，SOD含量顯著下降(P<0.05)

11、。Western-blot結果顯示，與空白組相比，PO（1200μM）刺激24h可顯著上調(diào)Notch1、Hes1、Caspase3、Bax的表達（P<0.05)，下調(diào)Bcl-2的表達，降低Bcl-2/Bax比值（P<0.05)，而DAPT組上述蛋白表達變化沒有統(tǒng)計學意義。與Gen+PO組相比，PO+DAPT+Gen組可顯著上調(diào)Notch1、Hes1、Bax、Caspase3的表達（P<0.05)，下調(diào)Bcl-2表達，降低Bcl-2/Ba

12、x比值（P<0.05)，提示Gen拮抗HUVECs氧化應激損傷很可能是通過調(diào)控Notch1信號通路來實現(xiàn)。
　　結論：
　　1.PO呈濃度與時間依賴性地損傷HUVECs，Gen對PO刺激導致的HUVECs氧化應激損傷具有保護作用。
　　2.對氧磷可上調(diào)Notch1、Hes1、Caspase3、Bax蛋白，下調(diào)Bcl-2蛋白表達，降低Bcl-2/Bax比值損傷血管內(nèi)皮細胞，Gen通過調(diào)節(jié)上述蛋白表達保護HUVECs免受P