西尼羅病毒寡核苷酸基因芯片的初步研究.pdf

1、西尼羅病毒是一種蚊子或蜱螨類傳播的蟲媒病毒，分類學上屬于黃病毒屬的黃病毒科，為RNA病毒。西尼羅病毒具有致病性高和傳染性強的特點，可以導致西尼羅熱或西尼羅病毒腦炎，其宿主動物和傳播媒介在自然界廣泛存在。該病毒具有跨地區(qū)進行世界性廣泛傳播的能力，擴大流行的潛在危險性很大，已經(jīng)引起世界各國的高度重視。西尼羅病毒的RNA基因組全長約10962bp，包含一個編碼十個病毒蛋白的開放閱讀框。編碼三種結構蛋白(C，E，M)，7種非結構蛋白(NS1，N

2、S2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)。根據(jù)E蛋白基因序列差異，西尼羅病毒分為兩個病毒株系：株系1病毒能使人致病，分布在北美、歐洲、非洲、亞洲和澳大利亞等地區(qū)；株系2病毒只在非洲部分地區(qū)的動物中流行。本課題首先采用長片段RT-PCR技術構建了西尼羅株系1病毒(GenBank登錄號：AF196835)的cDNA亞克隆，可用于進一步構建西尼羅病毒全長感染性cDNA克隆，以便用于研究西尼羅病毒復制和病理過程的分子機制；其次，制

3、備了西尼羅病毒寡核苷酸基因芯片，為進一步研究多病毒聯(lián)合檢測芯片打下基礎。另外設計了寡核苷酸基因芯片的判別程序并將該程序應用于西尼羅病毒寡核苷酸基因芯片檢測結果的判別分析。 在西尼羅株系1病毒的cDNA亞克隆構建過程中，使用長片段RT-PCR技術對病毒RNA進行反轉錄是一個關鍵步驟。實驗中對長片段RT-PCR條件進行了優(yōu)化：第一，使用兩步法的反轉錄操作流程；第二，使用AMV和PrimeScriptRTase混合酶進行反轉錄反應。A

4、MV和PrimeScriptRTase在55℃時仍然具有較高的活性，在優(yōu)化的操作流程中應用50℃進行反轉錄反應；第三，根據(jù)引物Tm對退火溫度和延伸溫度進行了優(yōu)化，把PCR引物的退火溫度提高到65-67℃。在第二輪的PCR反應中又把延伸溫度提高到72℃，大約高于Tm5℃。實驗中共設計了4對引物，克隆的基因序列包括了西尼羅株系1病毒序列1-3631和8865-11030。設計的引物上引入相應的限制性酶切位點，通過這些限制性酶切位點可以將克隆

5、片段連接起來，這樣為制備西尼羅病毒全長感染性cDNA克隆做好了準備。在5’端的引物引入一個T7啟動子位點，可以使用T7RNA聚合酶進行體外轉錄。所構建的cDNA亞克隆包括了病毒的核衣殼蛋白、M蛋白序列、E蛋白序列、非結構蛋白1(NS1)、非結構蛋白2A(NS2A)和非結構蛋白5(NS5)的部分序列，可用于研究西尼羅病毒的感染、復制和病理機制，也可為基因工程疫苗的研制提供材料。 目前，西尼羅病毒檢測的傳統(tǒng)方法主要有間接免疫熒光、補

6、體結合試驗、噬菌斑減少中和試驗、血細胞凝集抑制反應和病毒分離技術。這些傳統(tǒng)的檢測方法一次只能確定或排除一種病毒，不能實現(xiàn)大規(guī)模高通量的檢測，并且人體對外來病毒產生免疫有一定的時滯，因此這些檢測方法在病毒感染的早期診斷中敏感性很低?；蛐酒夹g為西尼羅病毒的檢測提供了一種新的途徑?；蛐酒瑱z測的對象是DNA或RNA，只要人體內有病毒顆粒就能檢測，并能同時對多種病毒進行檢測，具有獨特的優(yōu)點。 基因芯片(genechip)又稱DNA芯

7、片，是專門用于核酸檢測的生物芯片，可分為cDNA芯片和寡核昔酸芯片兩種。本課題制備了用于西尼羅病毒檢測的寡核苷酸基因芯片。實驗中以西尼羅病毒株NY99為材料，將抽提的RNA逆轉錄后使用限制性顯示技術對樣品進行熒光標記。針對西尼羅病毒基因設計12條長度為60mer的寡核苷酸探針，然后將探針固定在氨基化的芯片片基上，通過樣品與探針的雜交實驗篩選高特異性和高靈敏度的寡核苷酸探針。同時我們將黃熱病毒、乙腦病毒和登革病毒的樣品進行逆轉錄后使用限制

8、性顯示技術對樣品進行熒光標記，然后與西尼羅病毒寡核苷酸基因芯片雜交，用來檢驗探針的特異性。我們使用篩選的探針建立西尼羅病毒寡核苷酸基因芯片系統(tǒng)，為進一步研究多病毒聯(lián)合檢測芯片打下了基礎。實驗中還對芯片檢測靈敏度與RT-PCR檢測靈敏度進行了對比研究。將西尼羅病毒的cDNA進行101、102、和103倍稀釋，分別進行芯片實驗，結果顯示：病毒的cDNA原液、101和102倍稀釋液都能夠檢測出西尼羅病毒樣品，而103倍稀釋液的芯片實驗不能檢測

9、出西尼羅病毒樣品。病毒的cDNA原液、101、102、和103倍稀釋液的RT-PCR實驗結果顯示：病毒的cDNA原液、101、和102倍稀釋液能夠檢測出西尼羅病毒樣品，而103倍稀釋液的RT-PCR實驗不能檢測出西尼羅病毒樣品。對芯片陽性對照探針的數(shù)據(jù)進行了統(tǒng)計學分析，差異無顯著性意義，說明質控系統(tǒng)穩(wěn)定。芯片實驗與RT-PCR實驗結果對比說明病毒檢測芯片的靈敏度與普通RT-PCR方法相當。 檢測芯片制備的過程中，存在多種因素影響

10、檢測結果的判別。如芯片類型、樣品的標記方法以及掃描設備和軟件等。芯片的檢測數(shù)據(jù)經(jīng)過掃描提取出來以后，需根據(jù)數(shù)據(jù)對實驗結果進行快速準確的判別，而檢測芯片的規(guī)格和待測的樣品各不相同，實驗結果的判別標準也不是一成不變的。通常，檢測芯片的結果主要由專業(yè)人員使用統(tǒng)計軟件或者手工計算進行人工判別，人工判別效率低并可能存在錯誤判別。因此，自動化、高效率的判別程序的開發(fā)將加快檢測芯片的推廣應用。本實驗使用VisualBasic6.0初步設計了檢測芯片的

11、判別程序，設計的判別程序可以識別芯片掃描儀輸出的數(shù)據(jù)文件，并可根據(jù)數(shù)據(jù)文件內的字段對數(shù)據(jù)進行自動選定。然后按照不同實驗的需要針對相應的字段設置篩選標準和閾值，根據(jù)這些篩選標準和閾值實現(xiàn)對檢測芯片的判別。判別程序可以查詢并注釋數(shù)據(jù)，包括生物芯片的相關信息及探針的生物學信息。判別程序完成分析后，會列出一個詳細的判別結果，包括檢測芯片中的各個樣品的檢測結果、參考值的范圍等。因此，通過判別程序對芯片掃描數(shù)據(jù)的分析、抽提和判別，初步實現(xiàn)了檢測芯片

12、結果的判別分析自動化。為開發(fā)高效、自動化的判別軟件打下了基礎。 綜上所述，本研究采用長片段RT-PCR技術構建了西尼羅株系1病毒的cDNA亞克隆；使用寡核苷酸探針制備了西尼羅病毒基因芯片，并進行了檢測芯片靈敏度的實驗室驗證；設計了檢測芯片的判別程序，為實現(xiàn)檢測芯片結果的自動化判別打下了基礎。結果證實，研制的西尼羅病毒基因芯片可成功用于西尼羅病毒的實驗室檢測。針對檢測芯片設計的判別程序可實現(xiàn)芯片數(shù)據(jù)的自動化判別分析，進而將芯片掃描