慢病毒介導(dǎo)過表達(dá)CXCR4基因修飾臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外遷移研究.pdf

1、目的：
　　 通過過表達(dá)趨化因子受體4(CXCR4)基因修飾的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)的建立，體外觀察hUC-MSCs細(xì)胞遷移，探討SDF1α-CXCR4軸介導(dǎo)的hUC-MSCs細(xì)胞遷移，以證實(shí)SDF1α-CXCR4在細(xì)胞遷移過程中的作用。
　　 方法：
　　 提取Wistar大鼠大腦組織總RNA通過RT-PCR獲取cDNA文庫;據(jù)Genebank獲得大鼠CXCR4編碼區(qū)全長序列，按照慢病毒載體酶切

2、位點(diǎn)，設(shè)計(jì)CXCR4上下游引物，通過聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)獲得CXCR4基因片段，與雙酶切線性化的慢病毒載體質(zhì)粒(pCDH1-MCS-EF1-copGFP)連接，完成過表達(dá)CXCR4的慢病毒載體質(zhì)粒（pCDH1-CXCR4-EF1-copGFP）的構(gòu)建;包裝慢病毒，并采用流式細(xì)胞儀測定慢病毒滴度;利用慢病毒感染hUC-MSCs，建立過表達(dá)CXCR4的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞群(Lenti-GFP-CXCR4-hUC-MSCs);采用Trans

3、well實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞群遷移，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 Wistar大鼠cDNA文庫構(gòu)建成功，通過PCR擴(kuò)增獲得大鼠CXCR4基因片段為1050bp，與pCDH1-MCS-EF1-copGFP連接成功，轉(zhuǎn)化獲得過表達(dá)CXCR4的慢病毒載體質(zhì)粒pCDH1-CXCR4-EF1-copGFP，包裝攜帶GFP的過表達(dá)CXCR4的第三代慢病毒成功，滴度為7.89×105 TCID50/mL?？筛腥緃UC-MSCs獲得L

4、enti-GFP-CXCR4-hUC-MSCs，熒光顯微鏡觀察示GFP表達(dá)可超過90％，經(jīng)體外培養(yǎng)傳代，Real time-PCR及Western blot檢測CXCR4表達(dá)持續(xù)增高，且不隨傳代次數(shù)增加而降低，與感染前hUC-MSCs相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Transwell小室檢測證明隨著SDF1α濃度增高，Lenti-GFP-CXCR4-hUC-MSCs遷移率比hUC-MSCs遷移率逐漸增高，p＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SDF1α的趨化作

5、用可被CXCR4的特異性抑制劑AMD3100阻斷。
　　 結(jié)論：
　　 過表達(dá)CXCR4慢病毒可感染hUC-MSCs; Lenti-GFP-CXCR4-hUC-MSCsCXCR4mRNA及蛋白表達(dá)含量均持續(xù)增高;SDF1α主要通過CXCR4發(fā)揮趨化作用，且細(xì)胞遷移率呈現(xiàn)出SDF1α濃度依賴性，這種趨化作用可被AMD3100阻斷;本實(shí)驗(yàn)采用體外實(shí)驗(yàn)，排除SDF1α之外的非研究因素影響，更具針對(duì)性研究SDF1α-CXCR4軸