慢病毒載體介導(dǎo)的hbFGF基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療肢體缺血的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　探討以慢病毒為載體介導(dǎo)人堿性成纖維生長(zhǎng)因子（human basic fibrob last growth factor,hbFGF）基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stem cell,BMSC）治療肢體缺血的可行性。
　　方法：
　　1、采用密度梯度離心方法獲取SD(Sprague Dawley)大鼠BMSC，用含有10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagl

2、e Medium)作為培養(yǎng)基，獲取第3—5代BMSC。
　　2、以慢病毒構(gòu)建人堿性成纖維生長(zhǎng)因子基因載體，轉(zhuǎn)染大鼠BMSC，獲取人堿性成纖維生長(zhǎng)因子基因修飾BMSC。
　　3、24只SD大鼠均切除右側(cè)股動(dòng)脈及其分支，形成后肢缺血模型鼠。成模后隨機(jī)分為4組（每組6只）：bFGF-BMSC組，缺血后肢肌內(nèi)多點(diǎn)注射bFGF基因修飾的BMSCs；GFP-BMSC組，缺血后肢肌內(nèi)多點(diǎn)注射攜帶綠色熒光蛋白（green fluoresce

3、nt protein，GFP）空載病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs;BMSC組，缺血后肢肌內(nèi)多點(diǎn)注射普通BMSCs；PBS組，肌內(nèi)注射與前者等體積的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）。
　　4、細(xì)胞移植4周后，取內(nèi)收肌和腓腸肌組織，一部分用于冰凍切片，記數(shù)微血管密度并觀察移植細(xì)胞的改變；另一部分用于western blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)bFGF、VEGF等在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、通過(guò)

4、密度梯度離心方法，可獲得相對(duì)純化的BMSC。
　　2、BMSCs接受慢病毒轉(zhuǎn)染2d后，在熒光顯微鏡下觀察到強(qiáng)烈的綠色熒光。
　　3、細(xì)胞移植2周后，受體動(dòng)物體內(nèi)可見(jiàn)綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞，其中GFP-BMSC組，GFP+細(xì)胞數(shù)（15.4±3.85）個(gè)/視野低于bFGF-BMSC組（26.6±3.51）個(gè)/視野（t=4.811，P=0.001）
　　4、干細(xì)胞在體內(nèi)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，但是GFP-BMSC組的GFP+CD31+

5、細(xì)胞數(shù)（7.0±2.12）/視野低于bFGF-BMSC組（14.0±1.58）/視野（t=5.916，P=0.000）。
　　5、BMSC組微血管密度為（24.0±4.3）/視野，明顯高于PBS組（8.8±4.5）/視野（t=2.65，P=0.017）；GFP-BMSC組（28.6±4.2）/視野，與BMSC組無(wú)差異（t=0.8，P=0.434）；bFGF-BMSC組（55.0±16.5）/視野，高于BMSC組（t=5.4，P=0