慢病毒載體介導(dǎo)NK4基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向治療胃癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 1、建立人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone-derived mesenchymal stemcells,hBMSCs)體外分離、培養(yǎng)、傳代的方法;
　　 2、構(gòu)建NK4和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescentprotein,EGFP)融合基因的重組慢病毒表達(dá)載體;
　　 3、探討hBMSCs在體內(nèi)外對(duì)胃癌的趨向性;
　　 4、觀察慢病毒介導(dǎo)NK4基因修

2、飾的hBMSCs對(duì)胃癌的治療效果及其相關(guān)抗腫瘤機(jī)制,期望為胃癌的基因治療探索一條新途徑。
　　 方法:
　　 1、hBMSCs分離培養(yǎng)及鑒定:采用全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng),流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34、CD44、CD45、CD105及骨誘導(dǎo)進(jìn)行鑒定,成骨采用茜素紅染色鑒定;
　　 2、采用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)從肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte Growth Fact

3、or,HGF)cDNA中克隆NK4基因,并經(jīng)測(cè)序鑒定;以攜帶EGFP的pGC-FU慢病毒載體系統(tǒng)作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的媒介,采用In-Fusion技術(shù)構(gòu)建NK4-EGFP融合基因的重組慢病毒表達(dá)載體,通過(guò)觀察熒光及Westernblot檢測(cè)GFP蛋白表達(dá):實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RTQ-PCR)檢測(cè)慢病毒滴度;
　　 3、將攜帶NK4-EGFP融合基因的慢病毒(Lenti-NK4)及僅攜

4、帶EGFP的慢病毒(Lenti-GFP)轉(zhuǎn)染hBMSCs,通過(guò)觀察熒光及流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染率確定最佳感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI);采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)及Western blot檢測(cè)Lenti-NK4轉(zhuǎn)染hBMSCs后NK4表達(dá):
　　 4、建立裸鼠胃癌皮下移植瘤模型:采用胃癌細(xì)胞:懸液皮下注射及瘤組織塊接種兩

5、種方法:建立胃癌腹腔種植轉(zhuǎn)移模型:采用胃癌細(xì)胞懸液及瘤組織塊細(xì)胞懸液腹腔注射兩種方法:
　　 5、hBMSCs對(duì)胃癌趨向性研究:(1)體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)采用Transwell共培養(yǎng)體系,下室培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株MKN45、胃上皮細(xì)胞株GES-1、同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(培養(yǎng)基),24小時(shí)后上室分別加入hBMSCs、hFB,24小時(shí)后取出小室,結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計(jì)數(shù)。(2)胃癌皮下移植瘤裸鼠成瘤后隨機(jī)分為三組(每組5只),分別尾靜脈注射hB

6、MSCs-GFP、hFB-GFP、Lenti-GFP,7天后處死裸鼠,取瘤體、心、肝臟、脾臟、肺、腎臟,冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察瘤體及各臟器GFP表達(dá)情況。
　　 6、以hBMSCs為載體的NK4基因治療對(duì)胃癌治療效果:32只裸鼠成瘤后隨機(jī)分為四組:hBMSCs-NK4治療組、Lenti-NK4治療組、hBMSCs-GFP對(duì)照組和PBS對(duì)照組,分別在分組后0、7、14、21天尾靜脈注射給藥;測(cè)量瘤體大小,按πabc/6計(jì)算體積

7、;HE染色觀察組織病理學(xué)變化,免疫組織化學(xué)方法(Immunohistochemistry,IHC)檢測(cè)CD31、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cellnuclear antigen,PCNA)表達(dá),原位缺口末端標(biāo)記法(terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果:
　　 1、分

8、離培養(yǎng)的hBMSCs流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示CD44、CD105陽(yáng)性,而CD34、CD45陰性,符合MSCs特征;hBMSCs經(jīng)骨誘導(dǎo)后茜素紅染色陽(yáng)性。
　　 2、構(gòu)建的NK4-EGFP融合基因的重組慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞后可正常表達(dá);重組慢病毒(Lenti-NK4)滴度為2×108TU/ml;Lenti-NK4轉(zhuǎn)染hBMSCs后熒光表達(dá)隨著時(shí)間延長(zhǎng)及MOI值增加而增強(qiáng)、增多;攜帶NK4基因的hBMSCs(hBMSCs-NK4

9、)NK4表達(dá)正常,NK4分泌量隨著MOI值增加而增加,同時(shí)也隨感染時(shí)間延長(zhǎng)而增加,最佳MOI值為50;MOI為50時(shí),Lenti-NK4轉(zhuǎn)染hBMSCs的轉(zhuǎn)染率達(dá)87.8％,Lenti-GFP轉(zhuǎn)染hBMSCs的轉(zhuǎn)染率為96.5％。
　　 3、4×106MKN45細(xì)胞懸液接種與瘤組織塊接種皮下移植瘤成瘤率100％,后者成瘤時(shí)間明顯短于前者(P＜0.05);107個(gè)瘤組織勻漿細(xì)胞懸液腹腔注射,成瘤率100％。
　　 4、hB

10、MSCs對(duì)胃癌趨向性:(1)上室培養(yǎng)hBMSCs的各組中,MKN45、GES-1、空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù)分別為239.5±54.3、43.57±4.6、37.3±4.7:MKN45組細(xì)胞數(shù)明顯高于GES-1組及空白對(duì)照組(P＜0.01),GES-1組與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05);上室培養(yǎng)hFB的各組中,MKN45、GES-1、空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù)分別為27.7±16.7、16.4±5.1、19.1±6.2,三組相比均無(wú)顯著差異(P＞0.

11、05);下室均培養(yǎng)MKN45時(shí),上室為hBMSCs組遷移至膜對(duì)側(cè)細(xì)胞數(shù)明顯高于上室為hFB組(P＜0.01),下室均培養(yǎng)GES-1時(shí),上室為hBMSCs組遷移至膜對(duì)側(cè)細(xì)胞數(shù)明顯高于上室為hFB組(P＜0.05),下室均為空白培養(yǎng)基時(shí),上室為hBMSCs組遷移至膜對(duì)側(cè)細(xì)胞數(shù)明顯高于上室為hFB組(P＜0.05)。(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示注射hBMSCs-GFP的5只裸鼠,瘤體內(nèi)均可見(jiàn)散在綠色熒光,而注射hFB-GFP的裸鼠,瘤體內(nèi)未見(jiàn)綠色熒

12、光,注射Lenti-GFP的5只裸鼠,僅有1例瘤體內(nèi)可見(jiàn)散在熒光。hBMSCs-GFP組瘤體內(nèi)熒光表達(dá)率明顯高于與hFB-GFP及Lenti-GFP組(P＜0.01)。hBMSCs-GFP組1例肝臟(20％)及1例肺(20％)有散在熒光,與瘤體內(nèi)熒光表達(dá)率相比明顯低(P＜0.05),心、腎、脾中未見(jiàn)GFP表達(dá)(P＜0.01)。
　　 5、以hBMSCs為載體的NK4基因治療對(duì)胃癌治療效果:(1)hBMSCs-NK4對(duì)皮下移植瘤治

13、療結(jié)果顯示hBMSCs-NK4治療組瘤體體積均明顯小于hBMSCs-GFP及PBS組(P＜0.05);Lenti-NK4治療組瘤體體積在各時(shí)段與PBS組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05),在第3周時(shí)小于hBMSCs-GFP組(P＜0.05),其余時(shí)間與hBMSCs-GFP組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05);hBMSCs-NK4治療組抑瘤率達(dá)52.2％,Lenti-NK4治療組抑瘤率為29.4％。(2)hBMSCs-NK4組瘤重1.94±0

14、.67g,明顯低于hBMSCs-GFP組及PBS組(P＜0.05);Lenti-NK4組瘤重2.16±0.49g,低于hBMSCs-GFP組及PBS組瘤重,但無(wú)顯著性差異(P＞0.05);(3)hBMSCs-NK4組壞死評(píng)分3.63±0.47,明顯低于兩對(duì)照組(P＜0.05):Lenti-NK4組腫瘤壞死評(píng)分為3.25±0.38,與兩對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P＞0.05);(4)hBMSCs-NK4組微血管密度(microvessel d

15、ensity,MVD)為5.6±1.47,明顯低于hBMSCs-GFP和PBS組(P＜0.05),:Lenti-NK4組瘤組織MVD低于hBMSCs-GFP和PBS組,但三組相比均無(wú)顯著性差異(P＞0.05);(5)hBMSCs-NK4和Lenti-NK4組凋亡指數(shù)(Apoptotic index,AI)分別為7.31±1.90、4.2±1.3,對(duì)照組hBMSCs-GFP和PBS組A1分別為2.69±0.55、1.95±0.91,hBM

16、SCs-NK4組AI均顯著高于Lenti-NK4組及兩對(duì)照組(P＜0.01),Lenti-NK4組AI亦顯著高于兩對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、采用全骨髓培養(yǎng)法可分離獲得高純度的hBMSCs;
　　 2、攜帶NK4的慢病毒能安全、有效地轉(zhuǎn)染hBMSCs,轉(zhuǎn)染后NK4基因可持續(xù)穩(wěn)定表達(dá):
　　 3、hBMSCs在體內(nèi)外對(duì)胃癌均有明顯趨向性;
　　 4、hBMSCs為載體的NK4基