淡豆豉異黃酮抗動脈粥樣硬化分子機制研究.pdf

1、目的：淡豆豉（SSP）是大豆成熟種子經發(fā)酵制成的藥食兼用的傳統(tǒng)藥物，多年來臨床僅用其解表除煩的功效。現代研究發(fā)現，淡豆豉中異黃酮類（Isoflavone）是它的主要活性成分，是淡豆豉發(fā)揮藥理活性的物質基礎。前期研究發(fā)現淡豆豉具有降低血糖，調節(jié)脂質代謝、保護主動脈內膜、抑制平滑肌細胞增殖等生物活性，對動脈粥樣硬化（AS）有明顯的保護作用。為闡明淡豆豉抗動脈粥樣硬化的作用機制、擴大淡豆豉的臨床應用及研制抗動脈粥樣硬化新藥，本研究采用原代培養(yǎng)

2、的大鼠血管平滑肌細胞（VSMC），從細胞以及分子等不同水平，系統(tǒng)探討了淡豆豉防治AS的作用機制。
　　 方法：
　　 1.淡豆豉異黃酮對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導大鼠血管平滑肌細胞增殖的影響
　　 1.1大鼠主動脈VSMC原代培養(yǎng)與鑒定
　　 采用組織貼塊法培養(yǎng)原代大鼠VSMC；α-actin細胞免疫組織化學技術鑒定VSMC，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及SM-actin染色陽性率。
　　 1.

3、2淡豆豉異黃酮對體外培養(yǎng)VSMC的細胞毒性檢測
　　 藥物濃度梯度設定為1、10、100、500、1000、5000、10000、50000μg/L，作用時間為24h；MTT法測定各孔的存活率，以OD值表示。
　　 1.3淡豆豉異黃酮對AngⅡ誘導的VSMC增殖的干預作用
　　 淡豆豉異黃酮干預濃度為如下梯度：10、50、100、200、500μg/L，預孵育時間1、4、12、24h；AngⅡ終濃度為10-7mo

4、l/L，與藥物共培養(yǎng)24h；MTT法進行測定，確定藥物抑制增殖的最佳作用濃度與作用時間。
　　 1.4 VSMC細胞周期檢測
　　 實驗分為正常對照組、AngⅡ模型組、淡豆豉異黃酮（50、100、200μg/L）+AngⅡ組、大豆異黃酮（ISO）（200μg/L）+AngⅡ組。淡豆豉異黃酮、大豆異黃酮預孵育時間均為24h；AngⅡ終濃度為10-7mol/L，與藥物共孵育24h；收集細胞，流式細胞儀檢測細胞周期。
　

5、　 2.淡豆豉異黃酮對增殖血管平滑肌細胞JAK2/STAT3信號轉導通路的影響
　　 2.1 AG490、淡豆豉異黃酮、大豆異黃酮對AngⅡ誘導的VSMC增殖的干預作用
　　 實驗分為正常對照組、AngⅡ模型組、AG490（50μmol/L）+AngⅡ組、淡豆豉異黃酮（50、100、200μg/L）+AngⅡ組、大豆異黃酮（200μg/L）+AngⅡ組。AG490于AngⅡ干預前16h進行孵育，淡豆豉異黃酮、大豆異黃酮

6、于AngⅡ干預前24h進行孵育。MTT法進行測定。
　　 2.2 AngⅡ受體（AT1R）mRNA表達水平檢測
　　 分組及藥物（AG490、淡豆豉異黃酮、大豆異黃酮）干預同2.1，AngⅡ刺激30min。Trizol法提取細胞總RNA，RT-PCR法測定VSMC細胞膜上AT1R的表達。
　　 2.3 JAK2/STAT3信號轉導通路相關蛋白表達檢測
　　 分組及藥物（AG490、淡豆豉異黃酮、大豆異黃酮

7、）干預同2.1，AngⅡ刺激2h。SDS裂解液提取細胞總蛋白，Western Blot檢測Janus激酶2（JAK2）、信號轉導和轉錄活化因子3（STAT3）蛋白及其磷酸化蛋白表達水平。
　　 結果：
　　 1.淡豆豉異黃酮對AngⅡ誘導大鼠血管平滑肌細胞增殖的影響
　　 1.1大鼠VSMC鑒定
　　 VSMC培養(yǎng)72h后即有細胞從組織周圍游出，成放射狀排列，細胞呈長梭形、三角形或不規(guī)則形，胞漿豐富，核卵

8、圓居中，有多個核仁，隨著爬出細胞的增多表現出VSMC特征的“峰谷”狀生長。α-actin抗體標記后，胞漿中可見大量棕黃色與細胞長軸平行的纖維細絲，大于97％的細胞SM-actin染色陽性。
　　 1.2淡豆豉異黃酮的細胞毒作用
　　 藥物濃度達到10μg/mL時，OD值較正常對照組顯著降低，多數細胞皺縮成球形、少數死亡細胞漂浮在孔中。提示藥物濃度大于10μg/mL時，出現明顯細胞毒作用。
　　 1.3淡豆豉異黃酮

9、對AngⅡ誘導的VSMC增殖的影響
　　 10-7mol/L AngⅡ可明顯促進VSMC增殖。淡豆豉異黃酮預孵育細胞，對AngⅡ誘導的增殖產生了不同程度的抑制作用：與AngⅡ組比較，50μg/L預孵育12、24h；100μg/L預孵育1、4、12、24h；200μg/L預孵育1、4、24h；500μg/L預孵育4h可使OD值顯著降低；10μg/L預孵育1、4、12、24h；50μg/L預孵育1、4h；200μg/L預孵育12h；

10、500μg/L預孵育1、12、24h OD值有下降趨勢，但無統(tǒng)計學意義。分析可知：淡豆豉異黃酮抑制VSMC增殖的最佳作用濃度為50、100、200μg/L；最佳預孵育時間為24h。
　　 1.4淡豆豉異黃酮對大鼠VSMC細胞周期的影響
　　 與正常對照組比較，AngⅡ組G0/G1期細胞比例明顯下降，S期細胞比例明顯增加；與AngⅡ組比較，各用藥組G0/G1期細胞比例明顯增加，S期細胞比例明顯下降。
　　 2.淡豆

11、豉異黃酮對增殖血管平滑肌細胞JAK2/STAT3信號轉導通路的影響
　　 2.1 AG490、淡豆豉異黃酮、大豆異黃酮對AngⅡ誘導的VSMC增殖的影響
　　 AngⅡ組OD值較正常對照組明顯升高；與AngⅡ組比較，AG490組、淡豆豉異黃酮100μg/L、200μg/L組、大豆異黃酮組OD值顯著降低，淡豆豉異黃酮50μg/L組OD值有下降趨勢，但無統(tǒng)計學意義。
　　 2.2對VSMC AT1R mRNA表達的影

12、響
　　 AngⅡ組AT1R表達較正常組明顯升高；與AngⅡ組比較，AG490組、淡豆豉異黃酮200μg/L組AT1R表達明顯降低，淡豆豉異黃酮100/μg/L組、大豆異黃酮組也使AT1R表達明顯下降，淡豆豉異黃酮50μg/L組AT1R表達水平下降，但無統(tǒng)計學意義。
　　 2.3對VSMC JAK2/STAT3信號轉導通路蛋白表達的影響
　　 各實驗組JAK2、STAT3蛋白總量無顯著差異。AngⅡ組磷酸化JAK

13、2（p-JAK2）、磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白表達較正常對照組明顯升高；與AngⅡ組比較，AG490組、淡豆豉異黃酮200μg/L組、大豆異黃酮組p-JAK2、p-STAT3表達明顯下降；淡豆豉異黃酮50μg/L組使p-STAT3表達顯著下降，p-JAK2蛋白表達水平有下降趨勢，但無統(tǒng)計學意義；淡豆豉異黃酮100μg/L組可下調p-JAK2、p-STAT3表達量，但無統(tǒng)計學意義。
　　 結論：淡豆豉異黃酮（10～50