祛痰化瘀通脈方抗動脈粥樣硬化分子機制研究.pdf

1、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是膽固醇大量堆積于血管壁形成粥樣硬化斑塊，使血管壁增厚和管腔狹窄的一種慢性炎癥改變，當(dāng)斑塊破裂或繼發(fā)血栓形成后，則轉(zhuǎn)為急性缺血性臨床事件，嚴(yán)重危害人類健康。
　　小窩(caveolae)是細(xì)胞表面直徑為50～100 nm的胞膜穴樣內(nèi)陷，小窩蛋白-1(Cav-1)是caveolae的主要組成成分，它通過對多種細(xì)胞功能和多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)參與AS的形成和發(fā)展。Cav-1參與內(nèi)皮型

2、一氧化氮合酶(eNOS)的調(diào)節(jié)，內(nèi)皮細(xì)胞Cav-1可發(fā)揮eNOS負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB的激活是血管內(nèi)皮細(xì)胞受損的始動機制之一，NF-κB激活后可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)是AS時內(nèi)皮細(xì)胞所表達(dá)的粘附分子，具有穩(wěn)定單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的粘附的作用。
　　中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“動脈粥樣硬化”屬于“瘀血”、“痰濁”的范疇，祛痰化瘀通脈方丹參為方中君藥，川芎、人參、山楂為臣藥，

3、黃連、澤瀉為佐藥，紅曲為使藥。該方具有益氣活血、化痰逐瘀功效，主治動脈粥樣硬化性冠心病痰凝血瘀證。我們前期實驗研究證實祛痰化瘀通脈方有顯著的抗AS作用，但是其作用機制尚未進(jìn)行深入探討。因此，本課題以AS發(fā)病過程中的Cav-1/eNOS/NF-κ B通路為突破口，在此基礎(chǔ)上探討祛痰化瘀通脈方治療AS的作用機理，揭示該方的作用靶點及調(diào)控機制，為中醫(yī)藥防治AS提供新的思路和作用靶點。
　　目的:
　　通過痰瘀互結(jié)證AS冠心病小型豬

4、模型的整體實驗和ox-LDL損傷HUVECs的離體實驗，多層次、多水平探討祛痰化瘀通脈方防治AS的作用和分子機制。
　　方法:
　　1.整體實驗
　　采用高脂飼料喂養(yǎng)加介入冠狀動脈拉傷術(shù)建立痰瘀互結(jié)證AS冠心病小型豬動物模型，實驗共分為8組：正常對照組；痰瘀互結(jié)證AS冠心病模型組；祛痰化瘀通脈方高、中、低劑量組；丹蔞片組；舒降之組；生脈膠囊組。各組于術(shù)后共連續(xù)給藥8周，光鏡觀察冠狀動脈病理學(xué)變化；于0周、高脂2周、高脂

5、6周(藥后4周)、高脂10周(藥后8周)測定血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、VLDL-C及TC/HDL-C比值均水平；免疫組化法檢測冠狀動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞Cav-1蛋白表達(dá)和NF-κB p65核移位變化；Western blot檢測冠狀動脈eNOS和ICAM-1蛋白表達(dá)。
　　2.離體實驗
　　在HUVECs原代培養(yǎng)、傳代、鑒定成功的基礎(chǔ)上，選擇2～5代細(xì)胞進(jìn)行實驗。實驗分為6組：正常對照組；ox-LDL模型組；祛痰

6、化瘀通脈方高、中、低劑量組；舒降之組。各組加入相應(yīng)含藥血清(正常組和模型組加入20％正常大鼠血清)預(yù)孵育2 h后，加入100 mg/Lox-LDL(正常組除外)刺激3 h或24 h后進(jìn)行各項指標(biāo)測定。MTT法檢測細(xì)胞活力；Real time RCR法檢測細(xì)胞Cav-1、eNOS、NF-κB p65和ICAM-1 mRNA表達(dá)；Western blot檢測細(xì)胞Cav-1、eNOS和ICAM-1蛋白表達(dá)；Griess法檢測細(xì)胞上清中NO含量

7、變化；免疫熒光法檢測細(xì)胞NF-κB p65核移位變化。此外，應(yīng)用Cav-1抑制劑β-甲基環(huán)糊精(β-MCD)，考察Cav-1是否參與ICAM-1的表達(dá)。β-MCD預(yù)孵育2 h后100 mg/L ox-LDL刺激24 h，Western blot檢測細(xì)胞ICAM-1蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.整體實驗
　　(1)與正常組相比，模型組小型豬冠狀A(yù)S形成，內(nèi)膜厚度、管壁狹窄率及內(nèi)膜厚度/中膜厚度比值均明顯增加(P<0.0

8、1)。與模型組相比，祛痰化瘀通脈方高、中劑量組，丹蔞片組及舒降之組冠狀動脈病變程度明顯減輕，其內(nèi)膜厚度、管壁狹窄率及內(nèi)膜厚度/中膜厚度比值均明顯小于模型組(P<0.05～0.01)；祛痰化瘀通脈方低劑量組和生脈膠囊組與模型組比較均無明顯差異。
　　(2)高脂10周，與正常對照組比較，模型組血清TG、TC、LDL-C、VLDL-C及TC/HDL-C比值均明顯增加(P<0.05～0.001)；與模型組相比，祛痰化瘀通脈方高、中劑量組、

9、丹蔞片組及舒降之組血清TG、TC、LDL-C、VLDL-C均明顯降低(P<0.05～0.01)，祛痰化瘀通脈方低劑量組TC、VLDL-C也明顯降低(P<0.05)，生脈膠囊組僅VLDL-C明顯降低(P<0.001)，其它血清脂質(zhì)指標(biāo)與模型組比較均無明顯差異。
　　(3)與正常組比較，模型組小型豬冠脈Cav-1蛋白表達(dá)和NF-κB p65核移位明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，祛痰化瘀通脈方高、中劑量組，丹蔞片組及舒降之組Ca

10、v-1蛋白表達(dá)和NF-κB p65核移位均明顯降低(P<0.05～0.01)；祛痰化瘀通脈方低劑量組和生脈膠囊組與模型組比較無明顯差異(P>0.05)。
　　(4)與正常組相比，模型組小型豬冠脈eNOS蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，祛痰化瘀通脈方中劑量組、丹蔞片組及舒降之組eNOS蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.01)，祛痰化瘀通脈方高、低劑量組和生脈膠囊組eNOS蛋白表達(dá)與模型組比較均無明顯差異(P>0.05)。

11、r>　　(5)與正常組相比，模型組小型豬冠脈ICAM-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，祛痰化瘀通脈方高、中劑量組，丹蔞片組，舒降之組和生脈膠囊組ICAM-1蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05～0.01)，祛痰化瘀通脈方低劑量組和模型組比較無顯著差異(P>0.05)。
　　2.細(xì)胞實驗
　　(1)HUVECs經(jīng)100 mg/L ox-LDL刺激后細(xì)胞活力顯著活性降低(P<0.01)；加入不同劑量祛痰化瘀通脈方和舒

12、降之含藥血清后，細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05～0.01)，祛痰化瘀通脈方三個劑量組存在一定量效關(guān)系。
　　(2)與正常組相比，模型組細(xì)胞Cav-1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，各組細(xì)胞Cav-1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05～0.01)。
　　(3)與正常組相比，模型組細(xì)胞eNOS mRNA和蛋白表達(dá)明顯低于正常組(P<0.01)；與模型組相比，各組細(xì)胞eNOS mRNA表達(dá)均明顯

13、上升(P<0.05～0.01)，其中以舒降之和祛痰化瘀通脈方高、中劑量組作用更為顯著(P<0.01)。
　　(4)與正常組相比，模型組細(xì)胞NF-κB p65mRNA表達(dá)和核移位顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，各組細(xì)胞NF-κB p65mRNA表達(dá)和核移位均低于模型組(P<0.05～0.01)。
　　(5)與正常組相比，模型組細(xì)胞ICAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，各組細(xì)胞ICAM-

14、1mRNA表達(dá)和核移位均低于模型組(P<0.05～0.01)。
　　(6)與正常組相比，模型組細(xì)胞上清液中NO含量明顯低于正常組(P<0.01)，與模型組相比，各組細(xì)胞上清NO含量顯著高于模型組(P<0.05)，其中舒降之組和祛痰化瘀通脈方高、中劑量組作用更加顯著(P<0.01)。
　　(7)與正常組相比，模型組細(xì)胞ICAM-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)，單獨應(yīng)用10-3mol/Lβ-MCD則對正常細(xì)胞ICAM-1蛋白

15、表達(dá)無影響(P>0.05)。與模型組相比，10-3mol/Lβ-MCD預(yù)孵育組ICAM-1表達(dá)明顯降低(P<0.05)
　　結(jié)論:
　　1.祛痰化瘀通脈方可顯著降低痰瘀互結(jié)證AS冠心病小型豬血脂水平，明顯減輕冠狀動脈AS病變程度，其機制與下調(diào)Cav-1表達(dá)和上調(diào)eNOS表達(dá)，抑制NF-κB活化和降低ICAM-1表達(dá)有關(guān)。
　　2.祛痰化瘀通脈方可提高ox-LDL損傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞活力，其作用機制與調(diào)節(jié)Cav-1/eNO