多形漢遜酵母表達(dá)平臺改進(jìn)及牛FSHα、β亞基的表達(dá).pdf

1、多形漢遜酵母(Hansenulapolymopha)是近幾年發(fā)展起來的作為真核細(xì)胞表達(dá)外源基因的一種甲醇酵母。我們利用本實驗室已有的漢遜酵母表達(dá)平臺，將其進(jìn)行改造，將來自漢遜酵母的25SrDNA、18SrDNA構(gòu)建到表達(dá)載體中，以提高外源基因拷貝數(shù)，并且利用漢遜酵母tRNA的豐富度及漢遜酵母密碼子的偏愛性設(shè)計不同的目的基因序列，以此來提到外源基因的表達(dá)量。通過報告基因綠色熒光蛋白(Modifiedgreenfluorescentprot

2、ein，mGFP5)和熒光素酶蛋白(fireflyluciferaseprotein,Luc)表明，我們所用的載體都完全可以在多形漢遜酵母中進(jìn)行有效表達(dá)外源真核基因，而且保持天然蛋白的活性和特性，25SrDNA可以提高目的基因拷貝數(shù)，從而提高目的基因的表達(dá)量。 我們根據(jù)牛的促卵泡激素(FollicleStimulatingHormone，F(xiàn)SH)α亞基的cDNA序列合成了FSHα亞基的原始基因，同時又根據(jù)漢遜酵母tRNA的豐富度

3、及漢遜酵母的密碼子的偏愛性分別設(shè)計合成了FSHα亞基片段；根據(jù)Genbank報道的牛的促卵泡激素(FSH)β亞基cDNA序列合成了FSHβ亞基的原始基因片段。并將上述片段分別連到已構(gòu)建的漢遜酵母表達(dá)載體pHFMD-Z-alpha-A上在漢遜酵母中進(jìn)行了分泌表達(dá)，采用Ni+柱親和層析，用ELISA檢測和Westernblot分析表明，根據(jù)漢遜酵母tRNA的豐富度設(shè)計的牛FSHα亞基cDNA基因和原始β亞基cDNA基因完全可以在漢遜酵母中表

4、達(dá)，且FSHα亞基的表達(dá)量達(dá)2mg/L。將FSHα亞基構(gòu)建到帶有25SrDNA的表達(dá)載體pHFMD-Z-alpha-A上與不帶5SrDNA的表達(dá)載體pHFMD-Z-alpha-A上在漢遜酵母中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)帶有25SrDNA的轉(zhuǎn)化子的表達(dá)量明顯高于不帶25SrDNA的轉(zhuǎn)化子。我們還比較了用甘油與甲醇做誘導(dǎo)劑的表達(dá)差異性，發(fā)現(xiàn)甲醇誘導(dǎo)遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于甘油誘導(dǎo)。本實驗首次實現(xiàn)了促卵泡激素α亞基和β亞基在漢遜酵母中的表達(dá)，為實現(xiàn)牛促卵泡激素全