紫球藻藻紅蛋白β亞基基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達.pdf

1、福建師范大學碩士學位論文紫球藻藻紅蛋白β亞基基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達姓名：吳義誠申請學位級別：碩士專業(yè)：微生物學指導教師：陳必鏈20090401中文文摘中文文摘紫球藻( P o r p h y r i d i u mc r u e n t u m ) 是一種紅藻門單細胞藻。在生長過程中，能合成大量的藻紅蛋白和胞外多糖等有效活性物質(zhì)。隨著藻紅蛋白( ( P h y e o e r y t h r i n ，P E ) 在醫(yī)藥和工業(yè)

2、領域的需求增大，高額的海藻養(yǎng)殖成本以及藻紅蛋白純化費用已成為藻紅蛋白廣泛應用的一個重要制約因素。加強藻紅蛋白基因結(jié)構(gòu)、基因功能的研究，對闡明光合作用分子機制、質(zhì)體起源與進化等重大的理論以及與提高光合效率進而提高作物產(chǎn)量等實際問題都具有重要的理論和實踐意義。另外利用發(fā)酵生產(chǎn)藻紅蛋白，提供食用和飼料蛋白，及利用藻膽蛋白基因?qū)Υ笮徒?jīng)濟海藻蛋白質(zhì)性狀進行基因工程改良，都需要藻膽蛋白基因結(jié)構(gòu)和功能研究的進展和突破。紫球藻細胞富含多糖和藻紅蛋白等次

3、生代謝產(chǎn)物，因而紫球藻基因組D N A 提取的關(guān)鍵步驟之一就是這些物質(zhì)與基因組D N A 的分離，使其D N A 釋放到抽提緩沖液中，此外還要考慮次級代謝產(chǎn)物及其相關(guān)酶類等雜質(zhì)的影響。本研究根據(jù)所選材料的特點，選取廣泛應用于植物及真菌D N A 提取的五種方法進行比較。結(jié)果顯示提取的基因組D N A 大小均約2 3k b ，五種方法所提的D N A 純度及產(chǎn)率有差別，蛋白酶K 法提取的D N A 褥率最大達3 ．3 l l a g ／I

4、 - t L ，C T A B 方法次之，但蛋白酶K 法提取的D N A 含有一些蛋白及R N A 等雜質(zhì)，改良C T A B 法提取的D N A 樣品完整性相對較好，A 2 6 0 ／A 2 3 0 和A 2 6 0 ／A 2 8 0 分別為2 ．0 9 和1 ．8 5 。綜合D N A 提取純度、得率、P C R 擴增和酶切效果，C T A B 法是五種方法中最適合紫球藻基因組D N A 提取的方法。近十幾年來，藻紅蛋白分子生物學的

5、研究進展較快，到目前為止，已對十幾種藻的藻紅蛋白基因進行了克隆和序列分析，其中主要是來自紅藻和藍藻。本研究是通過從N C B I基因庫中查閱到有關(guān)紅藻門藻紅蛋白基因序列，用C l u s t a l X l ．8 3 軟件對所查找的序列進行比對，得到紫球藻藻紅蛋白p 亞基基因兩側(cè)保守序列。利用生物軟件P r i m e r P r e m i e r 5 ．0 和O l i g o6 ．0 對該序列設計引物，再經(jīng)過P C R 、R T

6、- P C R 等技術(shù)，首次完成了紫球藻藻紅蛋白B 亞基、間隔序列及Q 亞基編碼區(qū)近5 ’端c D N A 序列和基因組D N A 序列的克隆及序列測定。其中1 3 亞基e D N A 全長由5 3 4 個堿基組成；c D N A 序列排布順序為5 ' U T R - r p e B ．間隔區(qū)．r p e A ；對紫球藻藻紅蛋白p 亞基基因組結(jié)構(gòu)分析表明，其基因編碼區(qū)無內(nèi)含子序列，由紫球藻藻紅蛋白p 亞基c D N A 序列推導