基于漢遜酵母細胞的新型乙肝表面抗原疫苗的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hcpatiffs B virus,HBV)感染是世界性的公共衛(wèi)生問題,其所致的慢性肝炎及其并發(fā)癥嚴重危害了人類健康。據(jù)統(tǒng)計,全球有3.7億左右的HBV感染者或病毒攜帶者。每年至少有100萬人死于慢性肝臟疾病,包括肝硬化和肝癌。目前,臨床上對慢性肝炎的治療主要是采用干擾素α和核苷類藥物。但是,治療效果不理想。
　　 疫苗是控制乙肝傳播最有效的手段。目前國內(nèi)外使用的乙肝疫苗主要由兩部分組成,乙肝表面抗原(HBsAg)

2、和佐劑,單獨乙肝表面抗原(HBsAg)的免疫原性較弱,佐劑用于增強抗原的免疫原性。目前被批準應(yīng)用于臨床的佐劑只有氫氧化鋁(alum),其主要增強Th2型免疫應(yīng)答,以體液免疫為主。
　　 對于HBV慢性感染者而言,機體免疫反應(yīng)不能有效清除病原體,一般認為機體對HBV產(chǎn)生了免疫耐受。打破慢性HBV感染的免疫耐受狀態(tài),有效地激活機體特異性體液免疫和細胞免疫是治療慢性肝炎的關(guān)鍵之一。研究表明,Th1型免疫以較強的細胞免疫和適度的體液免疫

3、反應(yīng)為特點,在宿主抵抗病毒、胞內(nèi)菌感染方面起重要作用。因此,開發(fā)一種安全的,能夠增強Th1型免疫應(yīng)答的佐劑,對控制乙肝具有重要的意義。
　　 TOLL樣受體(TKRs)屬于病原相關(guān)分子模式識別受體(PRR),PRR識別某些病原微生物或其產(chǎn)物所共有的高度保守的特定分子結(jié)構(gòu)稱為病原相關(guān)分子模式(PAMP)。TLRs與PAMP相互作用,不僅能激活先天性免疫應(yīng)答,而且還能促進抗原提呈細胞(APCs)識別病原體,產(chǎn)生共刺激信號而啟動獲得性

4、免疫反應(yīng),是聯(lián)系先天免疫和獲得性免疫的橋梁?，F(xiàn)在已經(jīng)有11種不同的TLRs配體被識別,許多種TLRs配體被用作疫苗佐劑的研究,如R.848和CpG分別是TLR7和TLR9的配體。
　　 樹突狀細胞(DCs)表面表達多種TLRs,在識別病原微生物表面PAMP及基因如CpG-ODN、單鏈和雙鏈RNA方面起重要作用。激活后的DCs轉(zhuǎn)向成熟階段,MHCⅠ、Ⅱ類分子及共刺激分子CD40,CD80,CD86表達增高,并分泌IL-12、IFN

5、-γ等細胞因子,促進NK細胞、巨噬細胞吞噬殺傷病原體的活性,增強天然免疫應(yīng)答。此時DCs抗原攝取能力大為降低,而抗原提呈能力增強,DCs遷移至次級淋巴組織,將抗原以MHC-抗原肽形式遞呈給T淋巴細胞,激活特異性細胞和體液免疫反應(yīng)。TLRs還可決定獲得性免疫的類型,大多數(shù)TLRs配體能夠誘生Th1型獲得性免疫反應(yīng)。
　　 已有研究表明,酵母細胞壁有很多佐劑成分,其能夠與DCs和巨噬細胞受體相互作用,這些受體包括TLR-2,TLR-

6、4,TLR-6,CDl1,Dectin-1,Dectin-2,DEC-205和甘露糖受體家族。酵母細胞被DCs吞噬以后,可以上調(diào)很多細胞表面分子的表達,包括粘附分子(ICAM-1,CD54),協(xié)同刺激因子(B7-1,B7-2,CDS0,CD86),MHCⅠ和MHCⅡ類分子,并刺激細胞因子IL-12的分泌。研究表明,釀酒酵母本身沒有致病性,臨床研究表明,熱滅活的重組酵母在機體中沒有明顯的副作用。利用熱滅活的表達腫瘤相關(guān)抗原的釀酒酵母細胞免

7、疫小鼠能夠產(chǎn)生針對腫瘤抗原特異性的T細胞免疫應(yīng)答和抗腫瘤活性。腫瘤相關(guān)抗原可通過MHCⅠ并MHCⅡ類分子交叉提呈,從而產(chǎn)生針對腫瘤相關(guān)抗原特異性Th和CTL,介導的免疫應(yīng)答。然而,釀酒酵母表達體系中還有一些不足之處,例如釀酒酵母產(chǎn)生的糖基化蛋白中,N-連接的聚糖可以產(chǎn)生過敏反應(yīng)。此外,這種酵母所用碳源有限。漢遜酵母是一種甲基營養(yǎng)型酵母,其能克服傳統(tǒng)酵母的不足,在漢遜酵母表達的糖蛋白中,N-連接的聚糖不會產(chǎn)生過敏反應(yīng)。漢遜酵母的碳源比較豐

8、富,其蛋白的產(chǎn)量比傳統(tǒng)的釀酒酵母高,并且漢遜酵母本身沒有致病性,可以推測漢遜酵母細胞可能是一種更加安全有效的疫苗佐劑。
　　 為評價重組漢遜酵母在疫苗佐劑中的應(yīng)用和漢遜酵母的特性,本研究擬應(yīng)用熱滅活的表達乙肝表面抗原的漢遜酵母細胞(Yeast-HBsAg)和酵母細胞空載體,研究在小鼠體內(nèi)誘生HBsAg特異性T細胞和B細胞免疫應(yīng)答的能力。首先設(shè)計表達乙肝表面抗原的漢遜酵母細胞。為了提高漢遜酵母細胞HBsAg的表達水平,對HBsAg

9、基因密碼子進行優(yōu)化,盡量采用漢遜酵母細胞偏愛的密碼子。PCR方法擴增出HBsAg的基因序列,將基因序列亞克隆到多拷貝表達載體中,然后將其電轉(zhuǎn)到漢遜酵母細胞中,誘導表達HBsAg。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn),HBsAg主要表達在漢遜酵母細胞內(nèi)。為比較分析酵母細胞成分的佐劑作用,同時制備熱滅活的表達乙肝表面抗原的漢遜酵母細胞(Yeast-HBsAg)和漢遜酵母細胞空載體(Yeast vector)。
　　 為評估上述制品在小鼠體內(nèi)誘生免疫應(yīng)答的水平

10、和特征,取6周齡BALB/c雌鼠,隨機分為5組,每組10只小鼠,分別利用PBS,HBsAg,HBsAg+alum(以alum作為HBsAg佐劑),Yeast vector,Yeast-HBsAg免疫小鼠。每4周免疫1次,共免疫3次。初次免疫2周后開始眼眶后靜脈叢插管采血,每隔2周采血1次。稀釋不同免疫組小鼠血清,然后用ELISA法檢測血清中anti-HBsIgG以及IgG1,IgG2a的抗體滴度。第3次免疫后1周,脫頸椎處死小鼠,無菌條

11、件下摘取脾臟,然后用氯化銨溶液裂解紅細胞,胎盤蘭染色,脾臟細胞計數(shù)。將小鼠脾臟細胞調(diào)整為2×106/ml,作細胞表面分子染色,包括CD11c,CD80,CD86,MHCⅡ;CD3,CD4,CD8。用流式細胞儀檢測小鼠脾臟DCs(CDllc),以及共表達CDS0,CD86和MHCⅡ的DCs;小鼠脾臟T(CD3+)細胞,以及CD4+T,CD8+T細胞,CellQuest軟件分析結(jié)果。計算DCs,T細胞占全脾臟細胞的比例,以及CD4+T,CD

12、8+T細胞在全脾臟T細胞中的比例。將脾臟細胞調(diào)整為4×106/ml,加入乙肝表面抗原(終濃度20μg/ml)刺激72小時,收集上清,ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4的水平。另一方面,將脾臟細胞調(diào)整為4×106/ml,加入乙肝表面抗原(終濃度20μg/ml)刺激72小時,加入CCK-8溶液,檢測脾臟細胞的增殖。此外,進一步用HBsAg抗原刺激脾臟細胞,做細胞內(nèi)細胞因子IFN-γ染色,流式細胞儀檢測脾臟CD4+T,CDS+T

13、細胞產(chǎn)生IFN-γ的水平,CellQuest分析實驗結(jié)果。進一步將小鼠脾臟細胞調(diào)整為2×106/ml,利用滅活的P815-s刺激脾臟細胞,檢測各組小鼠脾臟細胞的特異性殺傷活性。
　　 結(jié)果表明,Yeast-HBsAg免疫的小鼠全脾臟細胞數(shù)是HBsAg單獨免疫組的5.6倍,脾臟DCs是HBsAg單獨免疫組的13.6倍,脾臟T細胞數(shù)是HBsAg單獨免疫組的4.4倍。HBsAg+alum免疫小鼠的全脾臟細胞數(shù),DCs及T細胞數(shù)均為HB

14、sAg單獨免疫組的2.2倍左右。因此,與alum相比,漢遜酵母細胞能夠誘導更多的T細胞,DCs向脾臟聚集。
　　 Yeast-HBsAg能夠提高小鼠脾臟細胞表達CD80,CD86,MHCclassⅡ的DCs比例。而HBsAg,HBsAg+alum對小鼠脾臟DCs比例沒有顯著的影響。Yeastvector和Yeast-HBsAg對小鼠全脾臟細胞數(shù)、DCs、T細胞數(shù)以及表達CDS0,CD86,MHCclassⅡ的DCs比例的影響沒有

15、顯著差異,因此,Yeast-HBsAg對脾臟免疫細胞的影響主要是漢遜酵母細胞的作用。
　　 Yeast-HBsAg免疫的小鼠能夠產(chǎn)生較高水平的IgG,IgG1,IgG2a抗體。初次免疫6周后,Yeast-HBsAg免疫小鼠產(chǎn)生的抗體是HBsAg單獨免疫組的50倍,HBsAg+alum免疫小鼠產(chǎn)生的抗體是HBsAg單獨免疫組的12倍。因此,Yeast-HBsAg免疫小鼠產(chǎn)生的抗體明顯高于HBsAg+alum組。與HBsAg單獨免疫

16、組相比,Yeast-HBsAg能夠提高血清IgG2a/IgG1抗體的比值(HBsAg免疫組為0.195,Yeast-HBsAg免疫組為0.522),表明Yeast-HBsAg可以使免疫反應(yīng)偏向Th1方向。而alum作為HBsAg的佐劑不能夠提高IgG2a/IgG1的比值。Yeast-HBsAg免疫小鼠的脾臟細胞不但能夠發(fā)生明顯的增殖,而且能釋放大量的HBsAg特異性IFN-γ和IL-4。此外,脾臟CD4+T和CDS+T細胞均能夠產(chǎn)生IF

17、N-γ。而HBsAg+alum免疫組沒有檢測到T細胞免疫反應(yīng)。
　　 以上結(jié)果表明,Yeast-HBsAg既能夠誘導Th1方向的免疫應(yīng)答,也可以增強Th2方向的免疫應(yīng)答,同時,Yeast-HBsAg還能夠促進DCs成熟。而alum作為nBsAg的佐劑,只能增強Th2方向的免疫反應(yīng),不能誘生Th1方向的免疫應(yīng)答,不能促進DCs成熟。
　　 為單獨評價漢遜酵母的疫苗佐劑作用,將酵母細胞空載體(Yeast vector)與HB

18、sAg組合[以(HBsAg+yeast)表示HBsAg與漢遜酵母細胞空載體(Yeastvector)混合]免疫小鼠,研究HBsAg+yeast在小鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)。取6周齡BALB/c雌鼠隨機分為5組,每組10只小鼠,分別利用PBS,HBsAg,HBsAg+alum,Yeast vector,HBsAg+yeast免疫小鼠。每4周免疫1次,共免疫3次。眼眶后靜脈叢插管采血,ELISA法檢測血清中anti-HBsIgG以及IgG1,IgG

19、2a抗體的滴度。第3次免疫后1周,處死小鼠,分離脾臟細胞,HBsAg抗原刺激,分別檢測脾臟細胞增殖,IFN-γ和IL-4的分泌及脾臟CD4+T,CD8+T細胞產(chǎn)生IFN-γ的水平。
　　 試驗結(jié)果表明,HBsAg+yeast免疫的小鼠能夠產(chǎn)生較高水平的IgG,IgG1,IgG2a抗體。HBsAg+yeast免疫小鼠的脾臟細胞不但能夠產(chǎn)生較多的IFN-γ和IL-4,而且發(fā)生了明顯的增殖。脾臟CD4+T,CD8+T細胞均能夠產(chǎn)生IF

20、N-γ。HBsAg+yeast既能夠誘生Th1方向的免疫應(yīng)答,也可以增強Th2方向的免疫應(yīng)答。上述結(jié)果說明,HBsAg+yeast在小鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)和Yeast-HBsAg相近。提示漢遜酵母細胞可單獨發(fā)揮Th1型疫苗佐劑作用。
　　 綜上所述,漢遜酵母細胞作為重組載體或單獨的空載體均能夠誘導免疫細胞向脾臟聚集,促進DCs的成熟。Yeast-HBsAg和HBsAg+yeast不但能夠在小鼠體內(nèi)誘生Th1方向的免疫應(yīng)答,而且還能夠