基于漢遜酵母細(xì)胞的新型乙肝表面抗原疫苗的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hcpatiffs B virus,HBV)感染是世界性的公共衛(wèi)生問題,其所致的慢性肝炎及其并發(fā)癥嚴(yán)重危害了人類健康。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球有3.7億左右的HBV感染者或病毒攜帶者。每年至少有100萬人死于慢性肝臟疾病,包括肝硬化和肝癌。目前,臨床上對(duì)慢性肝炎的治療主要是采用干擾素α和核苷類藥物。但是,治療效果不理想。
　　 疫苗是控制乙肝傳播最有效的手段。目前國(guó)內(nèi)外使用的乙肝疫苗主要由兩部分組成,乙肝表面抗原(HBsAg)

2、和佐劑,單獨(dú)乙肝表面抗原(HBsAg)的免疫原性較弱,佐劑用于增強(qiáng)抗原的免疫原性。目前被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的佐劑只有氫氧化鋁(alum),其主要增強(qiáng)Th2型免疫應(yīng)答,以體液免疫為主。
　　 對(duì)于HBV慢性感染者而言,機(jī)體免疫反應(yīng)不能有效清除病原體,一般認(rèn)為機(jī)體對(duì)HBV產(chǎn)生了免疫耐受。打破慢性HBV感染的免疫耐受狀態(tài),有效地激活機(jī)體特異性體液免疫和細(xì)胞免疫是治療慢性肝炎的關(guān)鍵之一。研究表明,Th1型免疫以較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和適度的體液免疫

3、反應(yīng)為特點(diǎn),在宿主抵抗病毒、胞內(nèi)菌感染方面起重要作用。因此,開發(fā)一種安全的,能夠增強(qiáng)Th1型免疫應(yīng)答的佐劑,對(duì)控制乙肝具有重要的意義。
　　 TOLL樣受體(TKRs)屬于病原相關(guān)分子模式識(shí)別受體(PRR),PRR識(shí)別某些病原微生物或其產(chǎn)物所共有的高度保守的特定分子結(jié)構(gòu)稱為病原相關(guān)分子模式(PAMP)。TLRs與PAMP相互作用,不僅能激活先天性免疫應(yīng)答,而且還能促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞(APCs)識(shí)別病原體,產(chǎn)生共刺激信號(hào)而啟動(dòng)獲得性

4、免疫反應(yīng),是聯(lián)系先天免疫和獲得性免疫的橋梁?，F(xiàn)在已經(jīng)有11種不同的TLRs配體被識(shí)別,許多種TLRs配體被用作疫苗佐劑的研究,如R.848和CpG分別是TLR7和TLR9的配體。
　　 樹突狀細(xì)胞(DCs)表面表達(dá)多種TLRs,在識(shí)別病原微生物表面PAMP及基因如CpG-ODN、單鏈和雙鏈RNA方面起重要作用。激活后的DCs轉(zhuǎn)向成熟階段,MHCⅠ、Ⅱ類分子及共刺激分子CD40,CD80,CD86表達(dá)增高,并分泌IL-12、IFN

5、-γ等細(xì)胞因子,促進(jìn)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞吞噬殺傷病原體的活性,增強(qiáng)天然免疫應(yīng)答。此時(shí)DCs抗原攝取能力大為降低,而抗原提呈能力增強(qiáng),DCs遷移至次級(jí)淋巴組織,將抗原以MHC-抗原肽形式遞呈給T淋巴細(xì)胞,激活特異性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。TLRs還可決定獲得性免疫的類型,大多數(shù)TLRs配體能夠誘生Th1型獲得性免疫反應(yīng)。
　　 已有研究表明,酵母細(xì)胞壁有很多佐劑成分,其能夠與DCs和巨噬細(xì)胞受體相互作用,這些受體包括TLR-2,TLR-

6、4,TLR-6,CDl1,Dectin-1,Dectin-2,DEC-205和甘露糖受體家族。酵母細(xì)胞被DCs吞噬以后,可以上調(diào)很多細(xì)胞表面分子的表達(dá),包括粘附分子(ICAM-1,CD54),協(xié)同刺激因子(B7-1,B7-2,CDS0,CD86),MHCⅠ和MHCⅡ類分子,并刺激細(xì)胞因子IL-12的分泌。研究表明,釀酒酵母本身沒有致病性,臨床研究表明,熱滅活的重組酵母在機(jī)體中沒有明顯的副作用。利用熱滅活的表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的釀酒酵母細(xì)胞免

7、疫小鼠能夠產(chǎn)生針對(duì)腫瘤抗原特異性的T細(xì)胞免疫應(yīng)答和抗腫瘤活性。腫瘤相關(guān)抗原可通過MHCⅠ并MHCⅡ類分子交叉提呈,從而產(chǎn)生針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原特異性Th和CTL,介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。然而,釀酒酵母表達(dá)體系中還有一些不足之處,例如釀酒酵母產(chǎn)生的糖基化蛋白中,N-連接的聚糖可以產(chǎn)生過敏反應(yīng)。此外,這種酵母所用碳源有限。漢遜酵母是一種甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母,其能克服傳統(tǒng)酵母的不足,在漢遜酵母表達(dá)的糖蛋白中,N-連接的聚糖不會(huì)產(chǎn)生過敏反應(yīng)。漢遜酵母的碳源比較豐

8、富,其蛋白的產(chǎn)量比傳統(tǒng)的釀酒酵母高,并且漢遜酵母本身沒有致病性,可以推測(cè)漢遜酵母細(xì)胞可能是一種更加安全有效的疫苗佐劑。
　　 為評(píng)價(jià)重組漢遜酵母在疫苗佐劑中的應(yīng)用和漢遜酵母的特性,本研究擬應(yīng)用熱滅活的表達(dá)乙肝表面抗原的漢遜酵母細(xì)胞(Yeast-HBsAg)和酵母細(xì)胞空載體,研究在小鼠體內(nèi)誘生HBsAg特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。首先設(shè)計(jì)表達(dá)乙肝表面抗原的漢遜酵母細(xì)胞。為了提高漢遜酵母細(xì)胞HBsAg的表達(dá)水平,對(duì)HBsAg

9、基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化,盡量采用漢遜酵母細(xì)胞偏愛的密碼子。PCR方法擴(kuò)增出HBsAg的基因序列,將基因序列亞克隆到多拷貝表達(dá)載體中,然后將其電轉(zhuǎn)到漢遜酵母細(xì)胞中,誘導(dǎo)表達(dá)HBsAg。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),HBsAg主要表達(dá)在漢遜酵母細(xì)胞內(nèi)。為比較分析酵母細(xì)胞成分的佐劑作用,同時(shí)制備熱滅活的表達(dá)乙肝表面抗原的漢遜酵母細(xì)胞(Yeast-HBsAg)和漢遜酵母細(xì)胞空載體(Yeast vector)。
　　 為評(píng)估上述制品在小鼠體內(nèi)誘生免疫應(yīng)答的水平

10、和特征,取6周齡BALB/c雌鼠,隨機(jī)分為5組,每組10只小鼠,分別利用PBS,HBsAg,HBsAg+alum(以alum作為HBsAg佐劑),Yeast vector,Yeast-HBsAg免疫小鼠。每4周免疫1次,共免疫3次。初次免疫2周后開始眼眶后靜脈叢插管采血,每隔2周采血1次。稀釋不同免疫組小鼠血清,然后用ELISA法檢測(cè)血清中anti-HBsIgG以及IgG1,IgG2a的抗體滴度。第3次免疫后1周,脫頸椎處死小鼠,無菌條

11、件下摘取脾臟,然后用氯化銨溶液裂解紅細(xì)胞,胎盤蘭染色,脾臟細(xì)胞計(jì)數(shù)。將小鼠脾臟細(xì)胞調(diào)整為2×106/ml,作細(xì)胞表面分子染色,包括CD11c,CD80,CD86,MHCⅡ;CD3,CD4,CD8。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠脾臟DCs(CDllc),以及共表達(dá)CDS0,CD86和MHCⅡ的DCs;小鼠脾臟T(CD3+)細(xì)胞,以及CD4+T,CD8+T細(xì)胞,CellQuest軟件分析結(jié)果。計(jì)算DCs,T細(xì)胞占全脾臟細(xì)胞的比例,以及CD4+T,CD

12、8+T細(xì)胞在全脾臟T細(xì)胞中的比例。將脾臟細(xì)胞調(diào)整為4×106/ml,加入乙肝表面抗原(終濃度20μg/ml)刺激72小時(shí),收集上清,ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4的水平。另一方面,將脾臟細(xì)胞調(diào)整為4×106/ml,加入乙肝表面抗原(終濃度20μg/ml)刺激72小時(shí),加入CCK-8溶液,檢測(cè)脾臟細(xì)胞的增殖。此外,進(jìn)一步用HBsAg抗原刺激脾臟細(xì)胞,做細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾臟CD4+T,CDS+T

13、細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的水平,CellQuest分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。進(jìn)一步將小鼠脾臟細(xì)胞調(diào)整為2×106/ml,利用滅活的P815-s刺激脾臟細(xì)胞,檢測(cè)各組小鼠脾臟細(xì)胞的特異性殺傷活性。
　　 結(jié)果表明,Yeast-HBsAg免疫的小鼠全脾臟細(xì)胞數(shù)是HBsAg單獨(dú)免疫組的5.6倍,脾臟DCs是HBsAg單獨(dú)免疫組的13.6倍,脾臟T細(xì)胞數(shù)是HBsAg單獨(dú)免疫組的4.4倍。HBsAg+alum免疫小鼠的全脾臟細(xì)胞數(shù),DCs及T細(xì)胞數(shù)均為HB

14、sAg單獨(dú)免疫組的2.2倍左右。因此,與alum相比,漢遜酵母細(xì)胞能夠誘導(dǎo)更多的T細(xì)胞,DCs向脾臟聚集。
　　 Yeast-HBsAg能夠提高小鼠脾臟細(xì)胞表達(dá)CD80,CD86,MHCclassⅡ的DCs比例。而HBsAg,HBsAg+alum對(duì)小鼠脾臟DCs比例沒有顯著的影響。Yeastvector和Yeast-HBsAg對(duì)小鼠全脾臟細(xì)胞數(shù)、DCs、T細(xì)胞數(shù)以及表達(dá)CDS0,CD86,MHCclassⅡ的DCs比例的影響沒有

15、顯著差異,因此,Yeast-HBsAg對(duì)脾臟免疫細(xì)胞的影響主要是漢遜酵母細(xì)胞的作用。
　　 Yeast-HBsAg免疫的小鼠能夠產(chǎn)生較高水平的IgG,IgG1,IgG2a抗體。初次免疫6周后,Yeast-HBsAg免疫小鼠產(chǎn)生的抗體是HBsAg單獨(dú)免疫組的50倍,HBsAg+alum免疫小鼠產(chǎn)生的抗體是HBsAg單獨(dú)免疫組的12倍。因此,Yeast-HBsAg免疫小鼠產(chǎn)生的抗體明顯高于HBsAg+alum組。與HBsAg單獨(dú)免疫

16、組相比,Yeast-HBsAg能夠提高血清IgG2a/IgG1抗體的比值(HBsAg免疫組為0.195,Yeast-HBsAg免疫組為0.522),表明Yeast-HBsAg可以使免疫反應(yīng)偏向Th1方向。而alum作為HBsAg的佐劑不能夠提高IgG2a/IgG1的比值。Yeast-HBsAg免疫小鼠的脾臟細(xì)胞不但能夠發(fā)生明顯的增殖,而且能釋放大量的HBsAg特異性IFN-γ和IL-4。此外,脾臟CD4+T和CDS+T細(xì)胞均能夠產(chǎn)生IF

17、N-γ。而HBsAg+alum免疫組沒有檢測(cè)到T細(xì)胞免疫反應(yīng)。
　　 以上結(jié)果表明,Yeast-HBsAg既能夠誘導(dǎo)Th1方向的免疫應(yīng)答,也可以增強(qiáng)Th2方向的免疫應(yīng)答,同時(shí),Yeast-HBsAg還能夠促進(jìn)DCs成熟。而alum作為nBsAg的佐劑,只能增強(qiáng)Th2方向的免疫反應(yīng),不能誘生Th1方向的免疫應(yīng)答,不能促進(jìn)DCs成熟。
　　 為單獨(dú)評(píng)價(jià)漢遜酵母的疫苗佐劑作用,將酵母細(xì)胞空載體(Yeast vector)與HB

18、sAg組合[以(HBsAg+yeast)表示HBsAg與漢遜酵母細(xì)胞空載體(Yeastvector)混合]免疫小鼠,研究HBsAg+yeast在小鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)。取6周齡BALB/c雌鼠隨機(jī)分為5組,每組10只小鼠,分別利用PBS,HBsAg,HBsAg+alum,Yeast vector,HBsAg+yeast免疫小鼠。每4周免疫1次,共免疫3次。眼眶后靜脈叢插管采血,ELISA法檢測(cè)血清中anti-HBsIgG以及IgG1,IgG

19、2a抗體的滴度。第3次免疫后1周,處死小鼠,分離脾臟細(xì)胞,HBsAg抗原刺激,分別檢測(cè)脾臟細(xì)胞增殖,IFN-γ和IL-4的分泌及脾臟CD4+T,CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的水平。
　　 試驗(yàn)結(jié)果表明,HBsAg+yeast免疫的小鼠能夠產(chǎn)生較高水平的IgG,IgG1,IgG2a抗體。HBsAg+yeast免疫小鼠的脾臟細(xì)胞不但能夠產(chǎn)生較多的IFN-γ和IL-4,而且發(fā)生了明顯的增殖。脾臟CD4+T,CD8+T細(xì)胞均能夠產(chǎn)生IF

20、N-γ。HBsAg+yeast既能夠誘生Th1方向的免疫應(yīng)答,也可以增強(qiáng)Th2方向的免疫應(yīng)答。上述結(jié)果說明,HBsAg+yeast在小鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)和Yeast-HBsAg相近。提示漢遜酵母細(xì)胞可單獨(dú)發(fā)揮Th1型疫苗佐劑作用。
　　 綜上所述,漢遜酵母細(xì)胞作為重組載體或單獨(dú)的空載體均能夠誘導(dǎo)免疫細(xì)胞向脾臟聚集,促進(jìn)DCs的成熟。Yeast-HBsAg和HBsAg+yeast不但能夠在小鼠體內(nèi)誘生Th1方向的免疫應(yīng)答,而且還能夠