FGL2基因沉默對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響及相關(guān)分子機制的初步研究.pdf

1、目的：
　　 特異性沉默心肌微血管內(nèi)皮細胞FGL2基因的表達后，觀察細胞形態(tài)功能以及增殖、凋亡能力的變化；探討FGL2沉默在心肌微血管內(nèi)皮細胞凋亡方面的作用機制。
　　 方法：
　　 (1)分離培養(yǎng)并鑒定MMVEC：取健康級新生雄性Wistar大鼠6～8 d8只，體重8～10 g，用組織貼塊法培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細胞，至原代內(nèi)皮細胞長成單層融合后，進行傳代。取第三代MMECs，免疫熒光檢測內(nèi)皮細胞重要標(biāo)志物FVⅢ及

2、CD31相關(guān)抗原。
　　 (2)從GeneBank中查找人纖維介素fg12(NM_006682)的堿基序列，按RNA干擾序列設(shè)計原則，設(shè)計4組針對FGL2基因cds區(qū)的靶序列，同時按公認標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計合成無意義序列作陰性對照(PSCNC)。每組序列均按發(fā)卡結(jié)構(gòu)模式設(shè)計合成，在其兩端設(shè)計酶切位點粘端，合成雙鏈DNA(引物)，與經(jīng)AgeI/EcoRI酶切的pGCSIL-GFP載體連接，產(chǎn)生pGCSIL-FGL2慢病毒載體，經(jīng)電泳篩選陽性克

3、隆，進行基因測序鑒定。再將慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細胞，包裝生產(chǎn)慢病毒，以系列稀釋法測定病毒滴度，Westernblot篩選出有效干擾靶點。DNA片段均由上海吉凱基因公司合成。
　　 (3)實驗分組：取培養(yǎng)的第三代MMVECs，共分三組：實驗A組：單純MMVECs(空白對照組)；實驗B組；空載質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染MMVECs組；實驗C組：FGL2RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染MMVECs組。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染4天后，熒光實時定量PCR(quantitativ

4、e real-time RT-PCR，qRT-PCR)檢測各組Bax、Bc1-2、Cox-2的mRNA表達。Westernblot檢測病毒轉(zhuǎn)染后MMVECs中FGL2蛋白的表達情況。病毒轉(zhuǎn)染后細胞的增殖能力用MTT法檢測。細胞的凋亡能力通過流式細胞儀檢測。
　　 結(jié)果：
　　 (1)原代心肌微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)成功，細胞呈典型的鋪路石樣結(jié)構(gòu)，純度約95％左右。
　　 (2)免疫熒光法檢測，顯示90％以上的細胞CD3

5、1、FVⅢ陽性，CD31主要分布在細胞膜，呈紅色熒光，F(xiàn)VⅢ主要分布在細胞胞漿，呈綠色熒光。
　　 (3)通過基因測序，表明FGL2RNAi慢病毒載體構(gòu)建成功。系列稀釋法測試包裝濃縮的慢病毒滴度為1×109TU/ml。轉(zhuǎn)染FGL2RNAi慢病毒96 h后，70-80％的MMVECs表達綠色熒光；MTT、流式細胞儀檢測結(jié)果顯示實驗C組與其它兩組細胞相比：細胞增殖能力明顯增強，凋亡明顯減少；qRT-PCR結(jié)果顯示，與實驗A組與B組比

6、較，實驗C組的FGL2、Bax、Cox-2表達明顯下調(diào)，Bc1-2的表達明顯上調(diào)，Westernblot檢測示：實驗C組FGL2蛋白表達明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而實驗A組與B組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 原代大鼠的心肌微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)成功，轉(zhuǎn)染FGL2RNAi慢病毒后的MMVECs中FGL2在RNA及蛋白水平表達明顯下調(diào)，在RNA水平Bc1-2表達明顯上調(diào)，Cox-2、Bax表達水平明