轉(zhuǎn)錄因子Nrf2對(duì)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管生成中作用的影響及其機(jī)制的體外研究.pdf

1、研究背景：
　　冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronaryatheroscleroticheartdisease，CAD)是當(dāng)今世界嚴(yán)重危害人類健康的常見心臟病之一，是主要的致殘和致死性疾病。如何有效地預(yù)防及治療冠心病已成為目前心血管疾病研究的重要領(lǐng)域。盡管藥物治療、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(percutaneouscoronaryinterventions，PCI)治療和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（coronaryarterybypassgra

2、fting，CABG）發(fā)展迅速，仍有10％～37％的冠心病患者因冠狀動(dòng)脈病變特殊性及其解剖因素的限制，不適合任何一種冠脈干預(yù)措施，或者僅接受了不完全的血運(yùn)重建治療，發(fā)生嚴(yán)重心肌缺血，心功能隨之減退，導(dǎo)致此類患者致殘和致死率極高。治療性血管生成即通過基因、蛋白和細(xì)胞水平的技術(shù)誘導(dǎo)新生血管形成、側(cè)枝血管的生長(zhǎng)，形成有血供的側(cè)枝循環(huán)。目前，治療性血管生成已成為那些不能經(jīng)常規(guī)血運(yùn)重建措施（例如PCI或CABG）達(dá)到血運(yùn)重建或完全血運(yùn)重建的嚴(yán)重/

3、晚期冠心病患者可供選擇的治療方式之一，治療性血管生成可通過增加缺血心肌的血供改善冠心病患者的癥狀、心臟功能和預(yù)后。眾所周知，心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(cardiacmicro-vascularendothelialcells，CMECs)是來源于冠狀循環(huán)微血管的一種特殊細(xì)胞類型，在血管生成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。
　　核因子轉(zhuǎn)錄因子2(NF-E2p45-relatedFactor2，Nrf2)是一種亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(basicleucine

4、zipper,bZip)轉(zhuǎn)錄因子，在機(jī)體抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用，其激活可導(dǎo)致下游多種抗氧化基因的表達(dá)，如血紅素加氧酶-1(Hemeoxygenase-1，HO-1)等。目前，已有國(guó)外研究證實(shí)Nrf2可促進(jìn)深層毛細(xì)血管數(shù)量的增加及促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的出芽生長(zhǎng)，在心血管保護(hù)方面亦有研究，如抑制心肌肥厚、保護(hù)心肌細(xì)胞避免缺血再灌注損傷及延緩動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生等。但Nrf2在冠心病梗死/缺血心肌血管生成中的作用及具體機(jī)制仍不甚清楚。同時(shí)，在缺血/

5、梗死心肌區(qū)域，Nrf2的自身激活是有限的。而血管生成效應(yīng)呈時(shí)間依賴現(xiàn)象，對(duì)促血管生成基因表達(dá)的高低也有相應(yīng)要求。因此，各種促進(jìn)心肌Nrf2高表達(dá)的干預(yù)因素，可通過增加治療性血管生成最終促進(jìn)心肌修復(fù)。
　　本課題以CMECs為研究對(duì)象，采用Nrf2基因轉(zhuǎn)染的方法，探討Nrf2是否促進(jìn)細(xì)胞體外血管生成，并進(jìn)一步闡明Nrf2是否通過調(diào)節(jié)HO-1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)其促血管生成作用。
　　研究方法：
　　第一部分 大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)

6、胞(CMECs)的分離、培養(yǎng)及鑒定與低氧和常氧條件下Nrf2及HO-1轉(zhuǎn)錄和蛋白水平表達(dá)的變化。
　　取健康成年SD雄性大鼠，經(jīng)手術(shù)取其心臟，采用組織貼塊法培養(yǎng)CMECs，第2代細(xì)胞行Ⅷ因子免疫組織化學(xué)鑒定為CMECs，實(shí)驗(yàn)采用第3-4代細(xì)胞。將CMECs分為正常對(duì)照組和短時(shí)間缺氧組:①缺氧(1h)組，②缺氧(2h)組，③缺氧(4h)組，④缺氧(12h)組，⑤缺氧(24h)組;經(jīng)缺氧孵箱培養(yǎng)不同時(shí)間后取出，以real-timeRT

7、-PCR及Westernblot法檢測(cè)細(xì)胞中Nrf2mRNA及蛋白表達(dá)變化。同時(shí)，將CMECs分為正常對(duì)照組和長(zhǎng)時(shí)間缺氧組:①缺氧(12h)組，②缺氧(24h)組，③缺氧(48h)組，④缺氧(72h)組;缺氧孵箱培養(yǎng)不同時(shí)間后取出，以real-timeRT-PCR及Westernblot法分別檢測(cè)細(xì)胞中Nrf2及HO-1mRNA及蛋白表達(dá)變化。上述實(shí)驗(yàn)確定缺氧能否激活Nrf2及導(dǎo)致HO-1水平的相應(yīng)變化。
　　第二部分 轉(zhuǎn)錄因子N

8、rf2對(duì)缺氧條件下CMECs遷移及成血管能力的影響及下游靶基因HO-1的調(diào)控。
　　將購買的Nrf2短發(fā)夾RNA慢病毒(Nrf2shRNALentiviralParticles，shRNA-Nrf2)及空載短發(fā)夾RNA慢病毒（controlshRNALentiviralParticles-A，shRNA-control）分別轉(zhuǎn)染CMECs，以RT-PCR及Westernblot法檢測(cè)Nrf2的mRNA及蛋白表達(dá)，確定干擾是否成功。

9、將CMECs分為:①單純CMECs對(duì)照組，②shRNA-control轉(zhuǎn)染CMECs組，③shRNA-Nrf2轉(zhuǎn)染CMECs組。采用Transwell小室法及Matrigelassay法分別檢測(cè)細(xì)胞遷移能力及成血管能力。以RT-PCR法檢測(cè)HO-1及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)mRNA水平變化，以Westernblot法及ELISA法分別檢測(cè)細(xì)胞中HO-1及VEGF的蛋白表

10、達(dá)變化。
　　第三部分 轉(zhuǎn)錄因子Nrf2促缺氧條件下CMECs遷移及成血管能力的作用及其機(jī)制研究
　　構(gòu)建Nrf2高表達(dá)的慢病毒及空載體，分別轉(zhuǎn)染CMECs，以real-timeRT-PCR及Westernblot法檢測(cè)Nrf2的mRNA及蛋白表達(dá)，確定過表達(dá)是否成功。將CMECs分為:①單純CMECs對(duì)照組，②空載慢病毒轉(zhuǎn)染CMECs組，③Nrf2高表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染CMECs組。采用real-timeRT-PCR及Weste

11、rnblot法檢測(cè)HO-1的mRNA及蛋白表達(dá)變化。
　　然后采用HO-1的活性抑制劑鋅原卟啉(Zincprotoporphyrin，Znpp)進(jìn)一步檢測(cè)及證實(shí)HO-1在Nrf2缺氧條件下促細(xì)胞遷移及成血管能力這一機(jī)制。將CMECs分為:①單純CMECs對(duì)照組，②空載慢病毒轉(zhuǎn)染CMECs組，③Nrf2高表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染CMECs組，④Nrf2高表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染CMECs+Znpp組。分別采用Transwell小室法及Matrigela

12、ssay法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力及成血管能力的變化。
　　研究結(jié)果：
　　(1)組織貼塊法培養(yǎng)的典型原代CMECs呈“鋪路石”樣形態(tài)，細(xì)胞采用免疫組織化學(xué)法予以鑒定，95％左右的細(xì)胞顯示Ⅷ因子陽性反應(yīng)。
　　(2)CMECs短時(shí)間缺氧（1、2、4、12及24h）狀態(tài)下，與正常氧濃度狀態(tài)下比較，Nrf2mRNA表達(dá)（由0.99±0.01上升至2.29±0.06）及蛋白表達(dá)（由0.28±0.03上升至0.42±0.02）水平于4

13、小時(shí)開始顯著上調(diào)(P＜0.01)，在24小時(shí)內(nèi)呈時(shí)間依賴性遞增現(xiàn)象。CMECs在長(zhǎng)時(shí)間缺氧（12、24、48及72h）條件下，與正常氧濃度比較，Nrf2mRNA及蛋白表達(dá)水平暫時(shí)性上調(diào)，至缺氧48小時(shí)表達(dá)最強(qiáng)(mRNA表達(dá):0h為0.98±0.02，48h達(dá)5.55±0.05;蛋白表達(dá):0h為0.27±0.02，48h達(dá)1.20±0.08。P＜0.01)，隨之其表達(dá)則開始下降。HO-1mRNA及蛋白表達(dá)的變化與Nrf2一致。
　　

14、(3)CMECs瞬時(shí)轉(zhuǎn)染shRNA-control和shRNA-Nrf2后，與shRNA-control組比較，干擾Nrf2顯著降低了Nrf2mRNA及細(xì)胞核蛋白的表達(dá)水平(mRNA表達(dá):由0.64±0.08降低至0.23±0.04，蛋白表達(dá):由0.73±0.02降低至0.36±0.01，P＜0.01)，同時(shí)顯著抑制了缺氧12hCMECs遷移及成血管能力，細(xì)胞遷移數(shù)目及脈管形成長(zhǎng)度分別由61.4±2.9和(5.50±0.10)mm減少至

15、38.8±3.7和(2.87±0.21)mm，(P＜0.01)。
　　(4)與shRNA-control組比較，干擾Nrf2顯著下調(diào)了缺氧12hCMECs中HO-1的mRNA及蛋白表達(dá)水平，分別由0.61±0.03和0.70±0.04降低至0.21±0.04和0.47±0.07，(P＜0.01)。VEGFmRNA及蛋白表達(dá)水平亦顯著下降(P＜0.01)。
　　(5)當(dāng)MOI=20時(shí)，慢病毒對(duì)CMECs的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)91.9±

16、1.3％(n=5)，CMECs的活性及形態(tài)不受明顯影響。CMECs瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Len-control和Len-Nrf2后，與Len-control組比較，Len-Nrf2組過表達(dá)Nrf2后顯著增加Nrf2mRNA及細(xì)胞核蛋白表達(dá)水平(mRNA表達(dá):由0.96±0.01上升至4.40±0.05，蛋白表達(dá):由0.33±0.03上升至0.77±0.03，P＜0.01)。
　　(6)Nrf2過表達(dá)顯著增加了缺氧12hCMECs中HO-1mRN

17、A及蛋白表達(dá)水平，HO-1mRNA表達(dá)由0.95±0.01上升至4.50±0.08(P＜0.01)，HO-1蛋白表達(dá)則由0.42±0.02上升至1.03±0.03(P＜0.01)。同時(shí)顯著增強(qiáng)了缺氧12h的CMECs遷移（細(xì)胞遷移數(shù)目:80.0±3.8）及成血管能力（脈管形成長(zhǎng)度:（62.8±3.5）mm，P＜0.01）。與轉(zhuǎn)染Len-Nrf2組比較，ZnPP（HO-1活性抑制劑）顯著抑制了Nrf2過表達(dá)后增加的細(xì)胞遷移及成血管能力（細(xì)

18、胞遷移數(shù)目由80.0±3.8減少至55.4±4.0，脈管形成長(zhǎng)度由(62.8±3.5)mm縮短為（49.6±2.7)mm,P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　(1)缺氧暫時(shí)上調(diào)了大鼠CMECs中Nrf2mRNA及蛋白表達(dá)的水平，伴HO-1mRNA及蛋白表達(dá)水平的相應(yīng)增加。
　　(2)轉(zhuǎn)染shRNA-Nrf2至CMECs，干擾Nrf2后，顯著抑制了缺氧條件下CMECs遷移及成血管能力。提示Nrf2在CMECs血管生成中發(fā)揮