抗LAG-3抗體對膿毒癥小鼠保護作用及免疫功能影響的研究.pdf

1、目的:
　　 膿毒癥(sepsis)是指由于創(chuàng)傷、感染等一系列因素引起機體過激的炎癥反應和免疫應答，繼而對機體產(chǎn)生嚴重危害的疾病，其病死率一直居高不下。膿毒癥病理生理過程中免疫系統(tǒng)的功能抑制是其中的一個非常突出問題，并已經(jīng)成為膿毒癥病死率居高不下以及各種治療效果不佳的重要原因。而在導致免疫抑制的各種原因中，淋巴細胞的凋亡以及功能障礙是一個重要的原因，但是其具體發(fā)生機制目前尚未完全清楚。
　　 淋巴細胞活化基因-3分子(l

2、ymphocyteactivationgene3，LAG-3，CD223)是免疫球蛋白超家族的一員，可負性調(diào)節(jié)免疫細胞的各項功能和生存周期。已有研究表明，LAG-3在病毒感染、自身免疫疾病以及腫瘤所致的免疫系統(tǒng)功能紊亂中發(fā)揮著重要作用，通過影響LAG-3的功能可以改善這些疾病演進過程中免疫功能失常狀態(tài)，從而改善疾病的預后。
　　 LAG-3分子在膿毒癥免疫抑制中扮演何種作用，干預LAG-3分子能否影響膿毒癥的預后和免疫系統(tǒng)功能尚

3、未見報道。為此，本實驗旨在研究盲腸結扎穿孔(cecalligationandpuncture，CLP)膿毒癥后LAG-3分子在小鼠不同免疫細胞上的表達變化；并探索應用抗LAG-3抗體治療后，是否對膿毒癥小鼠產(chǎn)生保護作用，是否會影響淋巴細胞凋亡及功能，并以此探求其在膿毒癥免疫抑制中的作用，以及膿毒癥免疫治療合理可靠的治療靶點。
　　 方法:
　　 1、采用CLP術致膿毒癥小鼠模型。將24只C57BL/6小鼠隨機分為假手術組

4、(n=10)和CLP組(n=14)，手術24h后流式細胞儀檢測CLP組和假手術組小鼠外周血CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、CD19+B淋巴細胞、自然殺傷(naturalkiller，NK)細胞、脾臟CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(regulatoryTcells，Treg)、樹突狀細胞(dendriticcell，DC)上的LAG-3表達水平。
　　 2、將81只C57BL/6小鼠隨機分為假手術組(Sham，n=9)

5、、CLP組(CLP，n=16)、CLP+腹腔注射抗LAG-3抗體組(i.p.Anti-LAG-3，n=16)、CLP+腹腔注射同型對照抗體組(i.p.Isotype，n=12)、CLP+尾靜脈注射抗LAG-3抗體組(i.v.Anti-LAG-3，n=16)和CLP+尾靜脈注射同型對照抗體組(i.v.Isotype，n=12)，手術后3h給予抗LAG-3抗體或同型對照抗體(均每只50μg/200μl)，觀察抗體干預后小鼠10d生存率及生存

6、時間。
　　 3、將55只C57BL/6小鼠隨機分為假手術組(Sham，n=7)、CLP組(CLP，n=18)、抗LAG-3抗體組(Anti-LAG-3，n=18)、同型對照抗體組(Isotype，n=12)，除假手術組外其余小鼠均行CLP術，并于手術后3h按分組分別經(jīng)腹腔給予抗LAG-3抗體或同型對照抗體(均每只50μg/200μl)。24h后取各組小鼠肺組織、外周血及腹腔沖洗液，檢測肺組織濕重/干重比值，血液及腹腔沖洗液細菌

7、負荷，以及血漿TNF-α、IL-6和IL-10水平。
　　 4、將33只C57BL/6小鼠隨機分為假手術組(Sham，n=8)、CLP組(CLP，n=9)、抗LAG-3抗體組(Anti-LAG-3，n=9)、同型對照抗體組(Isotype，n=7)，除假手術組外其余小鼠均行CLP術，并于手術后3h按分組分別經(jīng)腹腔給予抗LAG-3抗體或同型對照抗體(均每只50μg/200μl)。24h后取各組小鼠外周血、脾臟及胸腺，采用流式細胞儀

8、檢測各組小鼠外周血及脾臟CD4+、CD8+T淋巴細胞細胞計數(shù)，同時檢測小鼠胸腺T淋巴細胞凋亡情況。另取同樣分組及同樣處理的18只C57BL/6小鼠脾臟及胸腺，采用TUNEL法檢測其凋亡情況。
　　 5、取CLP術后18h小鼠脾臟，采用密度梯度法分離小鼠脾臟淋巴細胞，之后將分離得到的細胞分為兩部分，每部分設立對照組(Control)、抗LAG-3抗體組(Anti-LAG-3)和同型對照抗體組(Isotype)。一部分以抗CD3/抗

9、CD28抗體培養(yǎng)誘導細胞凋亡，72h后收集細胞檢測；另一部分用重組小鼠TNF-α培養(yǎng)誘導細胞凋亡，18h后收集細胞檢測。均采用流式細胞儀檢測各組CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞的凋亡情況。
　　 6、取CLP術后18h小鼠脾臟，采用密度梯度法分離小鼠脾臟淋巴細胞，之后將分離得到的細胞分為對照組(Control)、抗LAG-3抗體組(Anti-LAG-3)和同型對照抗體組(Isotype)，先以抗CD3/抗CD28誘導刺激細

10、胞生長67h，再采用PMA、離子霉素和BFA共同刺激細胞分泌細胞因子5h，之后收集細胞，并采用流式細胞儀檢測CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞細胞內(nèi)分泌IFN-γ的水平。
　　 7、取CLP術后18h小鼠脾臟，采用密度梯度法分離小鼠脾臟淋巴細胞，之后將分離得到的細胞分為對照組(Control)、抗LAG-3抗體組(Anti-LAG-3)和同型對照抗體組(Isotype)，先用CFSE標記細胞，后加入抗CD3/抗CD28抗體培

11、養(yǎng)刺激細胞增殖，5d后收集細胞，采用流式細胞儀檢測各組CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞的增殖情況。
　　 結果:
　　 1、CLP術后24h時，膿毒癥小鼠外周血CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、CD19+B細胞和NK細胞表面LAG-3表達較假手術組均非常顯著升高(P均小于0.01)；脾臟CD4+CD25+Treg、DC的表面的LAG-3表達較假手術組也均非常顯著升高(P均小于0.01)。
　　 2、C

12、LP術后3h給予抗LAG-3抗體，i.p.Anti-LAG-3組和i.v.Anti-LAG-3組小鼠生存率及生存時間顯著高于CLP組、i.P.Isotype組和i.v.Isotype組(P均小于0.05)。而i.p.Anti-LAG-3組和i.v.Anti-LAG-3組之間，以及i.p.Isotype組和i.v。Isotype組之間均差異無統(tǒng)計學意義(P均大予0.05)。
　　 3、體內(nèi)研究結果表明，Anti-LAG-3組小鼠肺

13、組織濕重/干重比值顯著低于CLP組及Isotype組(P均小于0.01)。此外，培養(yǎng)Anti-LAG-3組小鼠血液和腹腔灌洗液，其細菌菌落數(shù)均顯著低于CLP組及Isotype組(P均小于0.01)。促炎細胞因子TNF-α、IL-6還是抗炎細胞因子IL-10,Anti-LAG-3組均顯著低于CLP組及Isotype組(P均小于0.01)。
　　 4、體內(nèi)研究結果表明，Anti-LAG-3組小鼠外周血及脾臟CD4+T淋巴細胞、CD8

14、+T淋巴細胞計數(shù)均顯著高于CLP組和Isotype組(P均小于0.05)。Anti-LAG-3組小鼠胸腺CD3+細胞及CD3-細胞凋亡比例均顯著低于CLP組及Isotype組(P均小于0.05)。TUNEL結果顯示，Anti-LAG-3組小鼠胸腺及脾臟組織中TUNEL染色陽性的細胞比例均顯著低于CLP組和Isotype組(P均小于0.01)。
　　 5、體外抗CD3/抗CD28抗體誘導CLP小鼠脾臟淋巴細胞凋亡后顯示，Anti-

15、LAG-3組CD4+T細胞、CD8+T細胞凋亡比例顯著低于Control組和Isotype組(P均小于0.01)。而采用TNF-α誘導凋亡后CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞凋亡比例無差異(P均大于0.05)。
　　 6、體外刺激CLP小鼠脾臟淋巴細胞后顯示，Anti-LAG-3組IFN-γ+的CD4+T淋巴細胞比例顯著高于Control組及Isotype組(P均小于0.01)。而各組IFN-γ+的CD8+T淋巴細胞比例差異

16、無統(tǒng)計學意義(P均大于0.05)。
　　 7、體外檢測CLP小鼠脾臟淋巴細胞的增殖情況表明，Anti-LAG-3組CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞增殖比例均明顯高于Control組及Isotype組(P均小于0.01)。
　　 結論:
　　 CLP致膿毒癥小鼠外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD19+B細胞、NK細胞、脾臟Treg細胞、DC上的LAG-3表達水平均明顯升高。應用抗LAG-3抗體之后，可

17、以明顯延長CLP小鼠的生存率和生存時間，且無論經(jīng)腹腔還是經(jīng)靜脈用藥均有效，兩種給藥方式之間無差異。在體應用抗LAG-3抗體之后，對CLP小鼠起到了明顯的保護作用，表現(xiàn)在肺組織濕重/干重比值降低，血液和腹腔細菌負荷明顯減輕，血漿促炎和抗炎細胞因子水平下降。在免疫細胞功能方面，本研究結果提示：①在體應用抗LAG-3抗體后CLP膿毒癥小鼠外周血和脾臟CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞，胸腺各發(fā)育階段細胞凋亡均有明顯減少，TUNEL結果也提

18、示CLP膿毒癥小鼠胸腺和脾臟凋亡情況有所減輕；②體外研究結果提示，抗LAG-3抗體主要參與保護了T淋巴細胞受體(Tcellreceptor，TCR)途徑而非TNF-α-TNFR途徑誘導的T淋巴細胞凋亡；③體外應用抗LAG-3抗體后，抗LAG-3抗體可以促進CD4+T淋巴細胞分泌WN-γ，向具有促進細胞免疫效應的1型輔助性T細胞(Thelpercell1，Th1)方向分化，但對CD8+T淋巴細胞分泌促炎細胞因子方面無明顯改善作用；④體外應