抗PD-L1抗體對(duì)膿毒癥肝損傷小鼠的治療作用及機(jī)制研究.pdf

1、[研究目的]
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在研究盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)膿毒癥小鼠肝臟PD-L1分子的表達(dá)變化;探索應(yīng)用抗PD-L1抗體治療對(duì)膿毒癥小鼠是否具有肝治療作用，并檢測(cè)其對(duì)肝臟內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的影響，以此探求其在膿毒癥肝損傷中的作用，為膿毒癥肝功能保護(hù)性的治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 [研究方法]
　　 1、將16只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham，n=

2、8)、CLP組(CLP，n=8)，采用CLP術(shù)致膿毒癥模型。于手術(shù)后24h取小鼠肝臟，分離左葉、右葉。左葉切割為約1.5 cm×1.5 cm×1 cm大小后，立即行組織冰凍包埋，于冰凍切片機(jī)上行切片（厚度5μm）。切片經(jīng)固定后行抗PD-L1的免疫組織化學(xué)染色，抗體標(biāo)記物為辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)。顯微鏡下觀察并分析兩組切片中PD-L1表達(dá)水平。右葉切割出1cm×1 cm×1cm大小，經(jīng)勻漿后

3、提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后行Q-RT-PCR，定量檢測(cè)肝組織中PD-L1的mRNA表達(dá)水平。
　　 2、將32只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham，n=8）、CLP組(CLP, n=8)、同型對(duì)照組(Isotype，n=8)和抗PD-L1組(Anti-PD-L1，n=8)，除假手術(shù)組外其余小鼠均行CLP術(shù)，同型對(duì)照組和抗PD-L1組于CLP術(shù)后1h分別經(jīng)腹腔給予同型對(duì)照抗體或抗PD-L1抗體（50μg/200μl，每只）。

4、手術(shù)24 h后取小鼠心臟血檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase, ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartateaminotransferase，AST），并取小鼠肝組織行固定、石蠟包埋、切片和蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，根據(jù)ALT、AST水平和肝臟病理切片鏡下觀察結(jié)果綜合評(píng)價(jià)肝功能損傷程度。另取各組小鼠肝組織，勻漿后提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后行Q-RT-PCR，檢測(cè)肝

5、組織中TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10的mRNA水平。
　　 [結(jié)果]
　　 1、肝臟冰凍切片免疫組織化學(xué)染色后，于顯微鏡下發(fā)現(xiàn)CLP小鼠肝臟中實(shí)質(zhì)細(xì)胞PD-L1表達(dá)陽(yáng)性，假手術(shù)組小鼠肝臟未見(jiàn)PD-L1表達(dá)。對(duì)肝組織勻漿并行Q-RT-PCR后，結(jié)果顯示CLP術(shù)后24 h的小鼠肝臟中PD-L1的mRNA表達(dá)較假手術(shù)組上調(diào)5.67倍(P＜0.01)。
　　 2、CLP術(shù)后24 h時(shí)，CLP組、同型對(duì)照組小

6、鼠的外周血血漿ALT和AST較假手術(shù)組顯著提高（P＜0.01），而抗PD-L1組小鼠外周血血漿ALT和AST較CLP組和同型對(duì)照組小鼠顯著降低(P＜0.01)。肝臟病理切片HE染色鏡下結(jié)果提示，CLP組和同型對(duì)照組小鼠的肝臟出現(xiàn)明顯的炎性浸潤(rùn)和細(xì)胞變性，而抗PD-L1組小鼠的肝臟損傷較CLP組則有所減輕。Q-RT-PCR結(jié)果表明，CLP組及同型對(duì)照組小鼠肝臟中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6和抗炎細(xì)胞因子IL-10的mRNA

7、水平較Sham組顯著上調(diào)(P＜0.01)?？筆D-L1組小鼠肝臟中IL-6、IL-10和TNF-α的mRNA水平較CLP組和同型對(duì)照組小鼠顯著升高，而IFN-γ的mRNA水平則顯著降低(P＜0.01)。
　　 [結(jié)論]
　　 CLP致膿毒癥小鼠可出現(xiàn)顯著的肝臟損傷，表現(xiàn)為血漿ALT和AST水平顯著升高，肝臟HE染色示肝臟變形及炎性浸潤(rùn)。膿毒癥小鼠肝臟PD-L1表達(dá)在蛋白水平和mRNA水平上均顯著上調(diào)。在體應(yīng)用抗PD-L1