腎內(nèi)源性干細(xì)胞在急性腎小管壞死修復(fù)中的作用.pdf

1、[研究背景及目的]
　　 急性腎小管壞死(Acute Tubular Necrosis,ATN)是急性腎功能衰竭最常見的類型,約占75％～80％。由于對受損腎小管的修復(fù)過程了解甚少,急性腎衰竭尚缺乏有效的治療方法,只能依靠透析維持、被動地等待其自行恢復(fù),因而死亡率仍然高達(dá)50％～80％[1]。近年研究發(fā)現(xiàn),干細(xì)胞參與了ATN的修復(fù)過程[2～4],但對干細(xì)胞的來源尚未明了。本實驗建立大鼠缺血再灌注ATN模型,通過觀察BrdU陽性細(xì)

2、胞在正常和ATN鼠腎臟的分布情況,并對這些陽性細(xì)胞分別采用Pax2、Vimentin和activaed caspase-3進行雙重染色,探討參與ATN修復(fù)過程的干細(xì)胞的來源。
　　 [材料與方法]
　　 1大鼠腎臟組織的收獲
　　 體重220g左右的6周齡雌性SD大鼠左腎動脈夾閉60min后再灌注(假手術(shù)對照組不夾閉左腎動脈),制作SD大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型(I/R)用BrdU標(biāo)記,術(shù)后第1、3、5、7、14

3、、21、28、56天處死大鼠,收集血樣和腎臟標(biāo)本。
　　 2 Scr、BUN測定經(jīng)心臟穿刺留取的大鼠血液2ml,靜置30min,3000r/min離心30min后收集血清,Beckman自動生化儀測定BUN,Scr值
　　 3石蠟包埋及石蠟切片
　　 腎臟組織經(jīng)過10％福爾馬林固定,梯度酒精脫水,石蠟包埋。石蠟切片成4μm組織切片,烤片60℃2h。
　　 4 HE染色
　　 石蠟切片經(jīng)過二甲苯脫蠟

4、,梯度酒精水化,蘇木素.伊紅染色,再梯度酒精及二甲苯脫水,封片。鏡檢
　　 5免疫組化EnVision法
　　 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。依次消除內(nèi)源性過氧化物酶活性,抗原修復(fù),組織背景封閉,滴加特異性抗體,酶標(biāo)記用ChewaMateTMEnVision+/HRP作用切片,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水、透明后封片,鏡檢。
　　 6免疫熒光雙標(biāo)法
　　 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水?？乖迯?fù),組織背景封閉,滴加特異

5、性抗體1。IgG-FITC標(biāo)記的熒光二抗作用。切片預(yù)處理。胃蛋白酶消化,2N HCl孵育。組織背景封閉,滴加特異性抗抗體2。IgG-TR標(biāo)記熒光二抗作用,最后用DAPI孵育15min。撈片,陰干,甘油封片。
　　 [結(jié)果]
　　 ATN組術(shù)后左腎出現(xiàn)明顯的近端腎小管上皮細(xì)胞廣泛性壞死,BrdU陽性細(xì)胞明顯增加,第3天達(dá)到高峰,顯著高于右腎和假手術(shù)對照組。雙重染色顯示BrdU陽性細(xì)胞同時表達(dá)Pax2和Vimentin,但未