草莓果實(shí)特異性啟動(dòng)子的克隆與功能分析.pdf

1、組成型啟動(dòng)子是植物基因工程中廣泛應(yīng)用的啟動(dòng)子類(lèi)型之一，可啟動(dòng)外源基因在受體植物中非特異性的持續(xù)、穩(wěn)定的表達(dá)，但不能從時(shí)間和空間上對(duì)外源基因的表達(dá)進(jìn)行有效的調(diào)控，這可能會(huì)造成植物在能源利用上的浪費(fèi)，甚至?xí)?duì)轉(zhuǎn)基因植物造成傷害。組織特異型啟動(dòng)子可以啟動(dòng)外源基因在受體植物的特定組織器官中高效表達(dá)，果實(shí)特異性啟動(dòng)子作為重要的組織特異性啟動(dòng)子，可以控制外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的果實(shí)中特異表達(dá)?？寺『脱芯抗麑?shí)特異性啟動(dòng)子，可為改良果實(shí)品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

2、 從Genbank中篩選了一個(gè)由差減文庫(kù)篩選得到的草莓基因組EST序列(Accession number：DY633382)，將推測(cè)對(duì)應(yīng)的基因簡(jiǎn)稱DY基因。對(duì)此EST序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)它與葡萄中的一個(gè)與果實(shí)成熟相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸激酶基因有很高的相似性(83％)。進(jìn)而，對(duì)草莓(Fragaria ananassa，Duch.cv Chandler)中DY基因的表達(dá)模式進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果顯示DY基因在果實(shí)中特異表達(dá)，且在不

3、同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量存在差異。在綠色果實(shí)期轉(zhuǎn)錄水平最高，在白色果實(shí)期轉(zhuǎn)錄水平最低，在轉(zhuǎn)變期和紅色果實(shí)期轉(zhuǎn)錄水平較白色果實(shí)期有所升高，但比綠色果實(shí)期稍低。RT-PCR結(jié)果表明DY基因是果實(shí)表達(dá)特異性的基因。 根據(jù)EST：DY633382序列設(shè)計(jì)特異引物，利用TAIL-PCR克隆得到了DY基因的起始密碼子上游的1021bp啟動(dòng)子序列。利用在線生物信息學(xué)軟件NSITE和PLACE分析該序列，結(jié)果表明DY基因啟動(dòng)子區(qū)TATA-box位于起始

4、位點(diǎn)上游的-32～27區(qū)段，該序列包含有18個(gè)可能的順式作用元件，如CCGTCG motif、GA-1、AT-rich F等。利用PCR獲得了DY基因啟動(dòng)子序列三個(gè)缺失片段，分別構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1305-DI-GUS、pCAMBA1305-DⅡ-GUS、pCAMBA1305-DⅢ-GUS。然后利用農(nóng)桿菌浸染的方法轉(zhuǎn)化煙草，通過(guò)PCR和Sourthern雜交分析的方法鑒定單拷貝插入的轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因煙草植株的組織化學(xué)染色分

5、析結(jié)果表明啟動(dòng)子序列的不同缺失片段都可以啟動(dòng)GUS基因在果實(shí)(子房)中特異性表達(dá)，在葉片、根、莖和花中沒(méi)有表達(dá)。GUS組織染色結(jié)果說(shuō)明在啟動(dòng)子的-523到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的區(qū)段存在調(diào)控基因果實(shí)特異表達(dá)的順式元件。植物表達(dá)載體pCAMBIA1305-DI-GUS、pCAMBIA1305-DⅡ-GUS、pCAMBIA1305-DⅢ-GUS在煙草果實(shí)(子房)中的表達(dá)強(qiáng)度比組成型表達(dá)載體pCAMBIA1305在煙草果實(shí)(子房)中的GUS基因表達(dá)強(qiáng)度

6、要低。在煙草果實(shí)發(fā)育時(shí)期I，轉(zhuǎn)pCAMBIA1305-DⅡ-GUS和pCAMBIA1305-DⅡ-GUS表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因煙草果實(shí)的GUS酶活性比pCAMBIA1305-DⅢ-GUS的表達(dá)強(qiáng)度高，且差異較大，推測(cè)存在于DY調(diào)控序列-699～-523區(qū)段的AT-rich F有增強(qiáng)基因表達(dá)的作用。 HyPRP基因在草莓果實(shí)中特異表達(dá)，其產(chǎn)物HyPRP是一類(lèi)富含脯氨酸的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白，與草莓果實(shí)成熟過(guò)程中果實(shí)內(nèi)多酚的錨定有關(guān)。利用PCR

7、方法得到了肋HyPRP基因的778bp的啟動(dòng)子序列。利用在線生物信息學(xué)軟件NSITE和PLACE分析該778bp啟動(dòng)子序列，結(jié)果表明在HyPRP啟動(dòng)子序列中，TATA-box位于起始密碼子上游-59～-56區(qū)段，包含有23個(gè)可能的上游元件，如ABRE、ACGT box、GT motif等。利用PCR擴(kuò)增了HyPRP基因啟動(dòng)子序列的兩個(gè)缺失片段，分別構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA1305-H I-GUS、pCAMBIA1305-HⅡ-G

8、US，然后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化煙草。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的GUS活性分析顯示，pCAMBIA1305-HⅠ-GUS和pCAMBIA1305-HⅡ-GUS中的GUS基因在轉(zhuǎn)基因煙草果實(shí)(子房)中特異表達(dá)，說(shuō)明啟動(dòng)子序列-581到起始密碼子的序列上存在調(diào)控基因果實(shí)特表達(dá)的順式作用元件。通過(guò)GUS酶活分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化pCAMBIA1305-HI-GUS的轉(zhuǎn)基因煙草果實(shí)(子房)酶活性大大高于轉(zhuǎn)化pCAMBIA1305-HⅡ-GUS的?？赡茉?778～