草莓果實特異性啟動子的克隆與功能分析.pdf

1、組成型啟動子是植物基因工程中廣泛應(yīng)用的啟動子類型之一，可啟動外源基因在受體植物中非特異性的持續(xù)、穩(wěn)定的表達(dá)，但不能從時間和空間上對外源基因的表達(dá)進(jìn)行有效的調(diào)控，這可能會造成植物在能源利用上的浪費，甚至?xí)D(zhuǎn)基因植物造成傷害。組織特異型啟動子可以啟動外源基因在受體植物的特定組織器官中高效表達(dá)，果實特異性啟動子作為重要的組織特異性啟動子，可以控制外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的果實中特異表達(dá)。克隆和研究果實特異性啟動子，可為改良果實品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

2、 從Genbank中篩選了一個由差減文庫篩選得到的草莓基因組EST序列(Accession number：DY633382)，將推測對應(yīng)的基因簡稱DY基因。對此EST序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)它與葡萄中的一個與果實成熟相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸激酶基因有很高的相似性(83％)。進(jìn)而，對草莓(Fragaria ananassa，Duch.cv Chandler)中DY基因的表達(dá)模式進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果顯示DY基因在果實中特異表達(dá)，且在不

3、同發(fā)育時期表達(dá)量存在差異。在綠色果實期轉(zhuǎn)錄水平最高，在白色果實期轉(zhuǎn)錄水平最低，在轉(zhuǎn)變期和紅色果實期轉(zhuǎn)錄水平較白色果實期有所升高，但比綠色果實期稍低。RT-PCR結(jié)果表明DY基因是果實表達(dá)特異性的基因。 根據(jù)EST：DY633382序列設(shè)計特異引物，利用TAIL-PCR克隆得到了DY基因的起始密碼子上游的1021bp啟動子序列。利用在線生物信息學(xué)軟件NSITE和PLACE分析該序列，結(jié)果表明DY基因啟動子區(qū)TATA-box位于起始

4、位點上游的-32～27區(qū)段，該序列包含有18個可能的順式作用元件，如CCGTCG motif、GA-1、AT-rich F等。利用PCR獲得了DY基因啟動子序列三個缺失片段，分別構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1305-DI-GUS、pCAMBA1305-DⅡ-GUS、pCAMBA1305-DⅢ-GUS。然后利用農(nóng)桿菌浸染的方法轉(zhuǎn)化煙草，通過PCR和Sourthern雜交分析的方法鑒定單拷貝插入的轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因煙草植株的組織化學(xué)染色分

5、析結(jié)果表明啟動子序列的不同缺失片段都可以啟動GUS基因在果實(子房)中特異性表達(dá)，在葉片、根、莖和花中沒有表達(dá)。GUS組織染色結(jié)果說明在啟動子的-523到轉(zhuǎn)錄起始位點的區(qū)段存在調(diào)控基因果實特異表達(dá)的順式元件。植物表達(dá)載體pCAMBIA1305-DI-GUS、pCAMBIA1305-DⅡ-GUS、pCAMBIA1305-DⅢ-GUS在煙草果實(子房)中的表達(dá)強度比組成型表達(dá)載體pCAMBIA1305在煙草果實(子房)中的GUS基因表達(dá)強度

6、要低。在煙草果實發(fā)育時期I，轉(zhuǎn)pCAMBIA1305-DⅡ-GUS和pCAMBIA1305-DⅡ-GUS表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因煙草果實的GUS酶活性比pCAMBIA1305-DⅢ-GUS的表達(dá)強度高，且差異較大，推測存在于DY調(diào)控序列-699～-523區(qū)段的AT-rich F有增強基因表達(dá)的作用。 HyPRP基因在草莓果實中特異表達(dá)，其產(chǎn)物HyPRP是一類富含脯氨酸的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白，與草莓果實成熟過程中果實內(nèi)多酚的錨定有關(guān)。利用PCR

7、方法得到了肋HyPRP基因的778bp的啟動子序列。利用在線生物信息學(xué)軟件NSITE和PLACE分析該778bp啟動子序列，結(jié)果表明在HyPRP啟動子序列中，TATA-box位于起始密碼子上游-59～-56區(qū)段，包含有23個可能的上游元件，如ABRE、ACGT box、GT motif等。利用PCR擴增了HyPRP基因啟動子序列的兩個缺失片段，分別構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA1305-H I-GUS、pCAMBIA1305-HⅡ-G

8、US，然后利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化煙草。對轉(zhuǎn)基因煙草的GUS活性分析顯示，pCAMBIA1305-HⅠ-GUS和pCAMBIA1305-HⅡ-GUS中的GUS基因在轉(zhuǎn)基因煙草果實(子房)中特異表達(dá)，說明啟動子序列-581到起始密碼子的序列上存在調(diào)控基因果實特表達(dá)的順式作用元件。通過GUS酶活分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化pCAMBIA1305-HI-GUS的轉(zhuǎn)基因煙草果實(子房)酶活性大大高于轉(zhuǎn)化pCAMBIA1305-HⅡ-GUS的?？赡茉?778～