棉花種子特異性表達(dá)啟動子的克隆及功能分析.pdf

1、隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展,種子已經(jīng)不再只是農(nóng)作物的繁殖器官,還作為如醫(yī)藥、化工等其他產(chǎn)業(yè)的生物載體。所以通過生物技術(shù)手段定向改良植物種子,已經(jīng)成為現(xiàn)代植物基因工程上的重要課題。而種子特異性表達(dá)啟動子則是進(jìn)行植物種子基因工程改良的重要工具。在目前生產(chǎn)試驗(yàn)上采用的啟動子大多數(shù)為組成型啟動子,可啟動外源基因在受體植物中非特異性的持續(xù)、穩(wěn)定的表達(dá),但不能從時間和空間上對外源基因的表達(dá)進(jìn)行有效的調(diào)控,這可能會造成植物在能源利用上的浪費(fèi),甚至?xí)?/p>

2、轉(zhuǎn)基因植物造成傷害。因此種子特異性啟動子的發(fā)育時期與組織部位特異性使其顯示出顯著的優(yōu)勢。因此,研究種子特異性啟動子的調(diào)控機(jī)理具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
　　 Lea(Late cmbryogenesis abundant)蛋白是胚胎發(fā)育后期在種子中大量積累的一系列蛋白質(zhì),因此,其調(diào)控序列可能提供一個很好的種子特異性表達(dá)啟動子來源。本研究從亞洲棉(Gossypiumarboreum L.)石系亞1號中克隆Lea蛋白的D113和D3

3、4基因的種子特異表達(dá)啟動子,對它們的種子特異性元件進(jìn)行分析,并對其功能做進(jìn)一步驗(yàn)證,以期為研究種子特異性啟動子提供試驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　 本研究通過PCR擴(kuò)增,從石系亞1號中克隆了Lea蛋白基因家族中D113基因上游1262 bp的調(diào)控序列和D34基因上游1445 bp的調(diào)控序列。DNA序列分析結(jié)果表明,克隆到的兩個片段與已報道的Lea蛋白基因同一家族該基因的對應(yīng)序列相似性分別達(dá)到97.43％和94.27％。生物信息學(xué)分析表

4、明,兩種啟動子的核苷酸序列除了含有基本啟動子元件外都還含有其它種子特異表達(dá)性表達(dá)元件,例如ABA應(yīng)答元件、G-box、E-box和A／T富集區(qū)等。但這兩種啟動子的順式作用元件的數(shù)量和序列分布都不同。此外,在D113啟動子序列中還發(fā)現(xiàn)含有種子特異性的RY基序。進(jìn)一步分析認(rèn)為,啟動子元件之間的協(xié)作關(guān)系,可以增強(qiáng)啟動子的種子特異性。
　　 采用接頭法,成功構(gòu)建了由D113啟動子和D34啟動子驅(qū)動報告基因GUS的新型植物表達(dá)載體pBI1

5、21-D113、pBI121-D34。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)發(fā)轉(zhuǎn)化擬南芥,對T0代種子進(jìn)行篩選,獲得部分轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),兩種啟動子的種子都染上藍(lán)色,而在葉、根、莖等部位都沒有染上藍(lán)色,說明兩種啟動子都是種子特異性表達(dá)的,在正常情況下不會引起功能基因在其他組織部位的特異表達(dá)。
　　 本試驗(yàn)中使用的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化效率較高。對卡那霉素和Agar A進(jìn)行濃度梯度設(shè)置,尋找擬南芥轉(zhuǎn)基因的篩選和植株生長的最適濃度。結(jié)果表