Hedgehog信號(hào)通路在慢性氟中毒大鼠軟骨損害中的作用及其機(jī)制.pdf

1、目的：通過體內(nèi)外染氟實(shí)驗(yàn)及體外Smo siRNA阻斷Hh信號(hào)通路，觀察氟致大鼠軟骨損害中Hh信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)水平變化及軟骨細(xì)胞凋亡情況，以探討氟中毒致軟骨損傷的發(fā)病機(jī)制，為地氟病的預(yù)防及治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:（1）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：36只健康SD大鼠按體重隨機(jī)分為對(duì)照組（飲用含氟量<1 mg/L自來(lái)水）、低氟組、高氟組（飲水含氟量分別為5 mg/L、50 mg/L），每組12只（雌雄各半）。飼養(yǎng)6個(gè)月后，股動(dòng)脈放血處死，應(yīng)用氟

2、離子電極法檢測(cè)各組大鼠尿氟、骨氟含量；HE染色后光鏡觀察關(guān)節(jié)軟骨組織病理形態(tài)學(xué)的改變； IHC和Wb法檢測(cè)軟骨組織Hh信號(hào)通路中Shh、Smo、BMP-2及凋亡相關(guān)調(diào)控蛋白Bcl-2及Bax表達(dá)情況。（2）體外實(shí)驗(yàn)：取1周齡健康SD大鼠4只，用機(jī)械-酶消化法分離關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞；甲苯胺藍(lán)對(duì)原代軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞傳至2代細(xì)胞融合至70％時(shí)，分別加入濃度為0（對(duì)照組）、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 m

3、M的含氟培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)72 h后采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況，篩選出最適氟濃度；以慢病毒為載體將Smo siRNA1~3轉(zhuǎn)入軟骨細(xì)胞，72 h后，Wb檢測(cè)Smo表達(dá)含量，篩選出抑制作用最強(qiáng)片段后將實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、氟中毒組、control siRNA（陰性對(duì)照）組及Smo siRNA組；各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后采用Wb檢測(cè)Shh、Smo、BMP-2、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況；逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)Shh、Smo、BMP-2

4、mRNA表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果：1、低氟組及高氟組的尿氟、骨氟（3.66±0.43、402.38±33.77；8.05±0.60、935.12±49.60）含量均較對(duì)照組（1.12±0.16、106.45±11.28）升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2、HE結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠軟骨邊緣基本整齊，細(xì)胞呈柱狀排列。隨著染氟劑量增加，各染氟組干骺端出現(xiàn)不同程度軟骨骨化，骨小梁增寬，具有硬化性氟骨癥改變

5、。3、Wb結(jié)果顯示，低氟組、高氟組Shh、Smo、BMP-2及Bax蛋白表達(dá)（0.86±0.09、0.92±0.11、1.02±0.10、0.91±0.14；1.11±0.15、1.17±0.15、1.13±0.12、0.92±0.11）較對(duì)照組（0.62±0.07、0.74±0.09、0.77±0.11、0.63±0.06）升明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)（0.78±0.03；0.57±0.09）較對(duì)照組（0.84±0.10）明顯降低，

6、 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。4、原代軟骨細(xì)胞提取成功，表現(xiàn)為經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色時(shí)，細(xì)胞內(nèi)可見紫紅色的異染顆粒。5、MTT結(jié)果顯示，染氟72 h后，濃度為0.125、0.25、0.5 mM組細(xì)胞活力（120.83±7.21、123.17±4.62、118.51±10.09）較對(duì)照組升高，濃度為1.0、2.0、4.0 mM組細(xì)胞活力（82.13±6.25、35.16±4.84、7.03±2.23）較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

7、（P＜0.05）。6、Smo siRNA1~3均可不同程度抑制Smo因子的表達(dá)，以Smo siRNA2片段抑制作用最強(qiáng)。7、Wb及逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示，氟中毒組與陰性對(duì)照組Shh、Smo及BMP-2蛋白（0.94±0.05、0.89±0.07、1.06±0.15；1.00±0.09、0.86±0.05、1.14±0.13）和mRNA（0.67±0.04、0.46±0.06、0.77±0.06；0.61±0.04、0.51±0.07、0.

8、79±0.06）的表達(dá)較空白對(duì)照組（0.70±0.06、0.69±0.06、0.83±0.12；0.53±0.06、0.34±0.03、0.69±0.06）明顯升高，Smo siRNA組（0.52±0.03、0.47±0.06、0.59±0.06；0.42±0.05、0.28±0.06、0.50±0.03）與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比其表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。8、流式結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率相比（11.04

9、±1.11），氟中毒組與陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率（18.49±0.80；17.97±1.07）明顯升高，Smo siRNA組（40.32±1.79）升高更為明顯。與空白對(duì)照組Bax、Bcl-2的表達(dá)及Bax/Bcl-2的比值（0.88±0.06；1.05±0.07；0.85±0.09）相比，氟中毒組與陰性對(duì)照組Bax表達(dá)（1.07±0.10；1.19±0.12）升高，Bcl-2表達(dá)（0.74±0.03；0.76±0.05）降低，Bax/Bc

10、l-2比值（1.45±0.13；1.56±0.15）升高，Smo siRNA組（1.39±0.10；0.50±0.03；2.29±0.21）變化更為明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：1、氟中毒時(shí)軟骨組織可出現(xiàn)不同程度的骨化，具有硬化性氟骨癥的病理改變。2、在一定條件下，低濃度的氟對(duì)大鼠原代軟骨細(xì)胞具有促進(jìn)增殖作用，而高濃度具有促進(jìn)凋亡作用。3、Hh信號(hào)通路可能與凋亡以及其它因素共同參與氟致軟骨損傷的機(jī)制及發(fā)病過