錯配修復基因hMLH1啟動子甲基化對子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的影響.pdf

1、研究目的： 子宮內(nèi)膜癌為女性生殖器三大惡性腫瘤之一，其高發(fā)年齡為58～61歲，約占女性生殖道惡性腫瘤的20﹪～30﹪，近幾年發(fā)病率有上升趨勢，主要考慮與肥胖、高血壓、糖尿病、絕經(jīng)期延遲，及各種原因導致的子宮內(nèi)膜只受雌激素的長期刺激，而又無孕激素的拮抗有關。 隨著分子生物學的發(fā)展，現(xiàn)代腫瘤學理論認為腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與的多階段過程，這些因素最終在不同階段作用于不同基因，引起相關基因的結構及表達水平改變，導致癌癥的

2、發(fā)生發(fā)展。抑癌基因功能的丟失可能通過多種途徑，目前普遍認為DNA異常甲基化改變是除缺失與突變之外導致抑癌基因表達失活的第3種機制，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著不可忽視的作用。 MSP即methylation-specific PCR，是研究DNA甲基化最常用的方法，其機制是用亞硫酸氫鹽修飾基因組DNA，使未甲基化的胞嘧啶轉變?yōu)槟蜞奏?，而已?jīng)甲基化的胞嘧啶則不變。然后針對甲基化和非甲基化的等位基因分別設計其各自特異性的引物，用這兩對引物

3、對同-DNA模板分別進行PCR擴增來檢測基因的甲基化及非甲基化狀態(tài)。如果應用甲基化特異性引物使基因片段擴增，提示該基因片段發(fā)生了甲基化；若應用非甲基化特異性引物使基因片段擴增，則提示該基因片段無甲基化。如果兩對引物都可以使DNA片段擴增，說明該基因片段有部分甲基化。該方法靈敏度高，只需要很少的DNA。錯配修復基因hMLH1位于染色體3P 21.3～23，全長2484bp，含2268 bp的開放讀碼框架，共19個外顯子，編碼756個氨基酸

4、，是細胞內(nèi)錯配修復系統(tǒng)的重要組成基因，負責對堿基錯配進行修復，它的缺陷可導致細胞突變頻率的增加，由此有可能造成微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、相關癌基因、抑癌基因突變的不斷累積，導致細胞惡變，腫瘤形成。本試驗從分子生物學水平上研究hMLH1基因在正常的增生期子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜癌組織中的甲基化情況，以及該基因所表達的蛋白在上述兩種組織的石蠟切片中的表達情況，旨在探討hMLH1基因的甲基化是否是子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制之一，可否作為子宮內(nèi)膜癌基因治療的靶點

5、。 試驗方法： 收集2004年3月～2006年10月在中山大學附屬第一醫(yī)院住院并且接受手術治療的子宮內(nèi)膜癌患者37例，同期因子宮肌瘤住院行全子宮切除患者的正常的增生期子宮內(nèi)膜組織20例，新鮮的組織在離體后即放入液氮內(nèi)保存。所取標本一部分用于提取DNA，另一部分用于做免疫組化試驗。所取標本均為子宮內(nèi)膜樣腺癌。按FIGO(2000年)標準進行手術一病理分期，Ⅰ期20例，Ⅱ期9例，Ⅲ期6例，Ⅳ期2例。其中高分化有22例，中分化

6、有13例，低分化有2例。患者年齡24-69歲，平均年齡49.4歲?；颊咝g前均未行化療、放療、免疫、激素治療等抗腫瘤治療。提取DNA行MSP試驗，檢測hMLH1的甲基化情況；應用免疫組化鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶染色法(S-P法)，檢測hMLH1在子宮內(nèi)膜癌及正常增生期子宮內(nèi)膜組織的表達情況。試驗結果采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析。兩種不同的組織標本進行比較，采用Chi-square檢驗或Fisher精確概率檢驗進行分析

7、，用Spearman相關系數(shù)檢測其相關性。檢驗水準α=0.05，以P<0.05認為差異有顯著性． 結果： hMLH1基因在子宮內(nèi)膜癌腫瘤組織中的甲基化率為43.2﹪(16/37)，在正常的子宮內(nèi)膜組織中的甲基化率為15﹪(3/20)。在腫瘤組織中，hMLH1的甲基化率明顯高于正常的子宮內(nèi)膜組織，兩者之間具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 免疫組化的結果表明：hMLH1蛋白在子宮內(nèi)膜癌腫瘤組織的表達率為51-3﹪(1

8、9/37)，在正常的增生期內(nèi)膜組織表達率為80﹪(16/20)。兩者之間具有統(tǒng)計學意義(P<0/05)。 其中子宮內(nèi)膜癌組織中檢測到的16例發(fā)生hMLH1甲基化的組織僅有2例表達(表達率12.5﹪)，未發(fā)生甲基化的21例中有17例表達(表達率80.9﹪)，兩者之間具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。且兩者之間呈負相關，相關系數(shù)為0.670。 正常子宮內(nèi)膜組織中檢測到的3例發(fā)生hMLH1甲基化的組織1例表達(表達率為33.3﹪

9、)，未發(fā)生甲基化的17例中有16例表達(表達率94.1﹪)，兩者之間具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩者之間仍呈負相關，相關系數(shù)為0.028。 本試驗中，通過分析甲基化與組織學類型、病理分級與分期、肌層浸潤、淋巴結轉移及宮頸浸潤之間的關系，檢測其P值均大于0.05，沒有統(tǒng)計學意義。 結論： 錯配修復基因hMLH1甲基化促進子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。 錯配修復基因hMLH1甲基化可能與腫瘤的浸潤、遠處轉移等惡性行為