錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1啟動(dòng)子甲基化對(duì)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的影響.pdf

1、研究目的： 子宮內(nèi)膜癌為女性生殖器三大惡性腫瘤之一，其高發(fā)年齡為58～61歲，約占女性生殖道惡性腫瘤的20﹪～30﹪，近幾年發(fā)病率有上升趨勢(shì)，主要考慮與肥胖、高血壓、糖尿病、絕經(jīng)期延遲，及各種原因?qū)е碌淖訉m內(nèi)膜只受雌激素的長(zhǎng)期刺激，而又無(wú)孕激素的拮抗有關(guān)。 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)代腫瘤學(xué)理論認(rèn)為腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與的多階段過(guò)程，這些因素最終在不同階段作用于不同基因，引起相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)及表達(dá)水平改變，導(dǎo)致癌癥的

2、發(fā)生發(fā)展。抑癌基因功能的丟失可能通過(guò)多種途徑，目前普遍認(rèn)為DNA異常甲基化改變是除缺失與突變之外導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)失活的第3種機(jī)制，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著不可忽視的作用。 MSP即methylation-specific PCR，是研究DNA甲基化最常用的方法，其機(jī)制是用亞硫酸氫鹽修飾基因組DNA，使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而已?jīng)甲基化的胞嘧啶則不變。然后針對(duì)甲基化和非甲基化的等位基因分別設(shè)計(jì)其各自特異性的引物，用這兩對(duì)引物

3、對(duì)同-DNA模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)基因的甲基化及非甲基化狀態(tài)。如果應(yīng)用甲基化特異性引物使基因片段擴(kuò)增，提示該基因片段發(fā)生了甲基化；若應(yīng)用非甲基化特異性引物使基因片段擴(kuò)增，則提示該基因片段無(wú)甲基化。如果兩對(duì)引物都可以使DNA片段擴(kuò)增，說(shuō)明該基因片段有部分甲基化。該方法靈敏度高，只需要很少的DNA。錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1位于染色體3P 21.3～23，全長(zhǎng)2484bp，含2268 bp的開(kāi)放讀碼框架，共19個(gè)外顯子，編碼756個(gè)氨基酸

4、，是細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)的重要組成基因，負(fù)責(zé)對(duì)堿基錯(cuò)配進(jìn)行修復(fù)，它的缺陷可導(dǎo)致細(xì)胞突變頻率的增加，由此有可能造成微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、相關(guān)癌基因、抑癌基因突變的不斷累積，導(dǎo)致細(xì)胞惡變，腫瘤形成。本試驗(yàn)從分子生物學(xué)水平上研究hMLH1基因在正常的增生期子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜癌組織中的甲基化情況，以及該基因所表達(dá)的蛋白在上述兩種組織的石蠟切片中的表達(dá)情況，旨在探討hMLH1基因的甲基化是否是子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制之一，可否作為子宮內(nèi)膜癌基因治療的靶點(diǎn)

5、。 試驗(yàn)方法： 收集2004年3月～2006年10月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院并且接受手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜癌患者37例，同期因子宮肌瘤住院行全子宮切除患者的正常的增生期子宮內(nèi)膜組織20例，新鮮的組織在離體后即放入液氮內(nèi)保存。所取標(biāo)本一部分用于提取DNA，另一部分用于做免疫組化試驗(yàn)。所取標(biāo)本均為子宮內(nèi)膜樣腺癌。按FIGO(2000年)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行手術(shù)一病理分期，Ⅰ期20例，Ⅱ期9例，Ⅲ期6例，Ⅳ期2例。其中高分化有22例，中分化

6、有13例，低分化有2例?；颊吣挲g24-69歲，平均年齡49.4歲?；颊咝g(shù)前均未行化療、放療、免疫、激素治療等抗腫瘤治療。提取DNA行MSP試驗(yàn)，檢測(cè)hMLH1的甲基化情況；應(yīng)用免疫組化鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶染色法(S-P法)，檢測(cè)hMLH1在子宮內(nèi)膜癌及正常增生期子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)情況。試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。兩種不同的組織標(biāo)本進(jìn)行比較，采用Chi-square檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)進(jìn)行分析

7、，用Spearman相關(guān)系數(shù)檢測(cè)其相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05認(rèn)為差異有顯著性． 結(jié)果： hMLH1基因在子宮內(nèi)膜癌腫瘤組織中的甲基化率為43.2﹪(16/37)，在正常的子宮內(nèi)膜組織中的甲基化率為15﹪(3/20)。在腫瘤組織中，hMLH1的甲基化率明顯高于正常的子宮內(nèi)膜組織，兩者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 免疫組化的結(jié)果表明：hMLH1蛋白在子宮內(nèi)膜癌腫瘤組織的表達(dá)率為51-3﹪(1

8、9/37)，在正常的增生期內(nèi)膜組織表達(dá)率為80﹪(16/20)。兩者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0/05)。 其中子宮內(nèi)膜癌組織中檢測(cè)到的16例發(fā)生hMLH1甲基化的組織僅有2例表達(dá)(表達(dá)率12.5﹪)，未發(fā)生甲基化的21例中有17例表達(dá)(表達(dá)率80.9﹪)，兩者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且兩者之間呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.670。 正常子宮內(nèi)膜組織中檢測(cè)到的3例發(fā)生hMLH1甲基化的組織1例表達(dá)(表達(dá)率為33.3﹪

9、)，未發(fā)生甲基化的17例中有16例表達(dá)(表達(dá)率94.1﹪)，兩者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩者之間仍呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.028。 本試驗(yàn)中，通過(guò)分析甲基化與組織學(xué)類型、病理分級(jí)與分期、肌層浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及宮頸浸潤(rùn)之間的關(guān)系，檢測(cè)其P值均大于0.05，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1甲基化促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。 錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1甲基化可能與腫瘤的浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等惡性行為