一種新型的疫苗載體——重組桿狀病毒用于日本血吸蟲(chóng)DNA疫苗的研究.pdf

1、目前血吸蟲(chóng)DNA疫苗在抗血吸蟲(chóng)疫苗研究中占據(jù)著主導(dǎo)地位。質(zhì)粒載體是最常用的DNA疫苗載體，由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率較低，影響了編碼抗原的有效表達(dá)，導(dǎo)致機(jī)體不能誘導(dǎo)足夠有效的免疫應(yīng)答，因此難以取得理想的抗血吸蟲(chóng)感染的保護(hù)效果。同時(shí)質(zhì)粒載體的容量較小可能會(huì)影響到大片段抗原分子和多價(jià)疫苗的應(yīng)用。如何增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效果已成為當(dāng)前抗血吸蟲(chóng)疫苗研究的重點(diǎn)。 病毒載體中的哺乳動(dòng)物病毒載體如痘苗病毒和腺病毒載體也可用于構(gòu)建DNA疫苗，雖然哺乳動(dòng)物

2、病毒載體克服了質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率和容量的不足，但由于自身的免疫原性和體內(nèi)存在針對(duì)這些病毒載體的抗體，應(yīng)用上也受到了限制。因此發(fā)展新的疫苗載體必將有助于血吸蟲(chóng)疫苗的研究。 而桿狀病毒屬于昆蟲(chóng)病毒，動(dòng)物體內(nèi)缺乏預(yù)先存在的抗體。桿狀病毒載體除具備常用病毒載體的優(yōu)勢(shì)外，還具有低毒、安全、制備簡(jiǎn)單和易于得到高滴度的病毒粒子等優(yōu)點(diǎn)，這些為桿狀病毒開(kāi)發(fā)成DNA疫苗的載體提供了理論基礎(chǔ)。在偽狂犬病病毒、丙型肝炎病毒和鼠瘧疾伯氏瘧原蟲(chóng)研究中，重組桿狀

3、病毒介導(dǎo)的外源基因的表達(dá)也能引起機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)，這些為桿狀病毒開(kāi)發(fā)成DNA疫苗的載體提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 此外，DNA疫苗和蛋白疫苗聯(lián)合免疫也可以提高DNA疫苗的免疫效果。本研究選用日本血吸蟲(chóng)26kDa谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Sj26)作為抗原分子，一方面探討桿狀病毒作為日本血吸蟲(chóng)DNA疫苗載體的可行性；另一方面觀察DNA疫苗和蛋白疫苗聯(lián)合免疫的協(xié)同作用。 一、日本血吸蟲(chóng)Sj26重組質(zhì)粒DNA疫苗和重組蛋白疫苗聯(lián)合免疫的保

4、護(hù)作用研究目的：觀察含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)的真核表達(dá)載體pEGFP-N3構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-Sj26的體外表達(dá)、免疫保護(hù)效應(yīng)及其與日本血吸蟲(chóng)26kDa谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶重組蛋白(rSj26GST)聯(lián)合免疫對(duì)小鼠抗日本血吸蟲(chóng)感染的保護(hù)作用。 方法：PCR擴(kuò)增Sj26基因并連入T載體進(jìn)行序列測(cè)定，正確重組的質(zhì)粒命名為pT1-Sj26。再將Sj26基因定

5、向克隆入含有EGFP的真核表達(dá)載體pEGFP-N3，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-Sj26。pEGFP-Sj26體外轉(zhuǎn)染幼倉(cāng)鼠腎(babyhamsterkidney,BHK)細(xì)胞，用熒光顯微鏡和蛋白質(zhì)印跡法(Westernblot)檢測(cè)蛋白表達(dá)。60只BALB/c小鼠隨機(jī)分為A、B、C、D、E5組，每組12只，每只小鼠均免疫3次，間隔2周。A組為PBS對(duì)照組，B組為pEGFP-N3組，C組為pEGFP-Sj26組，D組為rSj26GST組，E

6、組為pEGFP-Sj26+rSj26GST聯(lián)合免疫組。聯(lián)合免疫組先用pEGFP-Sj26免疫2次，再用rSj26GST加強(qiáng)免疫1次。以上各組均于末次免疫后2周進(jìn)行攻擊感染，感染45d后剖殺，計(jì)數(shù)蟲(chóng)荷和肝內(nèi)蟲(chóng)卵數(shù)，計(jì)算減蟲(chóng)率和肝組織中每條雌蟲(chóng)減卵率。結(jié)果：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連入T載體測(cè)序結(jié)果顯示Sj26基因與文獻(xiàn)報(bào)道的序列一致性為100％。重組質(zhì)粒pEGFP-Sj26構(gòu)建正確并成功轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光表達(dá)，Western

7、blot證實(shí)了pEGFP-Sj26能夠表達(dá)Sj26-EGFP融合蛋白。動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)顯示，pEGFP-Sj26和rSj26GST聯(lián)合免疫組的減蟲(chóng)率為50.8％，顯著高于pEGFP-Sj26單獨(dú)免疫組(28.0％)和rSj26GST單獨(dú)免疫組(25.5％)。聯(lián)合免疫組、rSj26GST組和pEGFP-Sj26組減卵率分別為32.7％、33.0％和20.6％。與PBS對(duì)照組相比，聯(lián)合免疫組和rSj26GST單獨(dú)免疫組肝組織中每條雌蟲(chóng)產(chǎn)卵數(shù)差

8、異有顯著性(P＜0.01)，pEGFP-Sj26單獨(dú)免疫組差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。 結(jié)論：含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的重組質(zhì)粒pEGFP-Sj26能成功地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)；重組質(zhì)粒DNA疫苗(pEGFP-Sj26)免疫對(duì)小鼠具有保護(hù)作用；pEGFP-Sj26和重組蛋白疫苗(rSj26GST)聯(lián)合免疫可以增強(qiáng)小鼠抗日本血吸蟲(chóng)感染的保護(hù)作用。 轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK細(xì)胞后，Westernblot證實(shí)重組桿狀病毒能夠在BHK細(xì)胞中表

9、達(dá)Sj26GST蛋白。 動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)顯示，vAcCMVSj26免疫小鼠后獲得了28.3％的減蟲(chóng)率和23.6％的減卵率，與空病毒和攻擊感染對(duì)照組比較，差異有顯著性。vAcCMVSj26和rSj26GST聯(lián)合免疫組的減蟲(chóng)率為44.0％，明顯高于vAcCMVSj26單獨(dú)免疫組(22.7％)和rSj26GST單獨(dú)免疫組(25.6％)。聯(lián)合免疫組、rSj26GST組和vAcCMVSj26組減卵率分別為25.5％、33.0％和23.9％，

10、與PBS對(duì)照組相比，肝組織中每條雌蟲(chóng)產(chǎn)卵數(shù)差異有顯著性(P＜0.05或0.01)。 結(jié)論：成功構(gòu)建了Sj26重組桿狀病毒；Sj26重組桿狀病毒能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)Sj26GST蛋白；桿狀病毒可以作為日本血吸蟲(chóng)DNA疫苗的載體；重組桿狀病毒介導(dǎo)的Sj26DNA疫苗(vAcCMVSj26)和重組蛋白(rSj26GST)疫苗聯(lián)合免疫可以產(chǎn)生協(xié)同保護(hù)作用。 課題的特色和創(chuàng)新點(diǎn)： 1)用含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的真核表達(dá)

11、載體pEGFP-N3構(gòu)建了日本血吸蟲(chóng)26kDa谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(Sj26)的重組質(zhì)粒DNA疫苗(pEGFP-Sj26)。本研究重組的質(zhì)粒能夠借助報(bào)告基因來(lái)顯示目的基因Sj26在體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)情況。 2)重組質(zhì)粒pEGFP-Sj26免疫小鼠后能產(chǎn)生一定的抗日本血吸蟲(chóng)感染的保護(hù)作用。3)首次構(gòu)建了以桿狀病毒為載體的日本血吸蟲(chóng)DNA疫苗并證實(shí)其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能有效表達(dá)。 4)首次證明了重組桿狀病毒介導(dǎo)的DNA疫苗能產(chǎn)