日本血吸蟲Wnt分泌相關(guān)蛋白的抑制研究及Wnt1的鑒定分析.pdf

1、血吸蟲(Schistosome)感染人及多種哺乳動(dòng)物，具有重要公共衛(wèi)生意義。Wnt信號(hào)通路是參與調(diào)控胚胎形態(tài)發(fā)育和生長(zhǎng)，成體組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)等生物學(xué)過程的保守的信號(hào)通路。Wnt蛋白的分泌對(duì)Wnt信號(hào)通路的開啟具有重要意義，本研究利用Wnt信號(hào)蛋白分泌抑制劑及RNA干擾Wnt信號(hào)蛋白分泌相關(guān)基因(Porcupine及Wntless)來阻礙Wnt蛋白的分泌，探索Wnt信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制對(duì)日本血吸蟲生長(zhǎng)發(fā)育及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的影響;同時(shí)，對(duì)日本血吸

2、蟲Wnt1基因進(jìn)行鑒定。
　　1.日本血吸蟲Wnt分泌相關(guān)蛋白的抑制研究
　　選擇以Porcn為靶點(diǎn)的Wnt信號(hào)蛋白分泌抑制劑C59給體外培養(yǎng)血吸蟲添加及給感染血吸蟲的小鼠口服，觀察對(duì)體外培養(yǎng)和宿主體內(nèi)生長(zhǎng)蟲體的Wnt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)及產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)Wnt信號(hào)通路成員基因mRNA水平進(jìn)行比較，確定20nmol/L為C59的最佳作用濃度;添加C59的第6天，體外培養(yǎng)的14天童蟲的Wnt信號(hào)通路開始受到

3、相對(duì)持續(xù)的抑制;添加C59的第7天體外培養(yǎng)的7天及14天童蟲作用蟲體的Wnt信號(hào)通路受到抑制程度最大;C59對(duì)14天童蟲Wnt信號(hào)通路的抑制效果要比7天童蟲更明顯。熒光定量PCR分析，結(jié)果顯示C59處理的7天童蟲及14天童蟲的促凋亡相關(guān)因子及DNA損傷相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度的上調(diào)，且14天蟲體這些基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)的程度更大，推測(cè)是Wnt信號(hào)通路的抑制程度越大，細(xì)胞就更趨于凋亡。體外培養(yǎng)的14天蟲體的掃描電鏡結(jié)果顯示:C59組蟲

4、體與DMSO組及空白對(duì)照組相比，體表結(jié)構(gòu)沒有明顯差別，表明C59的添加未對(duì)蟲體的體被屏障產(chǎn)生直接的刺激和損傷。透射電鏡結(jié)果顯示: C59組蟲體超微結(jié)構(gòu)模糊不清，腸腔上皮脫落，腸管微絨毛較少、斷裂等變化，推測(cè)是由于Wnt信號(hào)通路的抑制導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境不能維持穩(wěn)定，引起細(xì)胞凋亡甚至壞死，這與C59組凋亡相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)的結(jié)果吻合。C59作用于體內(nèi)寄生的日本血吸蟲的研究結(jié)果顯示，可引起蟲體大部分Wnt信號(hào)通路成員轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，其中Wnt/β-cat

5、enin信號(hào)通路的成員基因及Wnt/Ca2+信號(hào)通路成員基因下調(diào)程度相對(duì)較大，推測(cè)童蟲階段Wnt/β-catenin信號(hào)通路及Wnt/Ca2+信號(hào)通路的調(diào)節(jié)功能活躍;C59可用于對(duì)宿主體內(nèi)蟲體Wnt信號(hào)通路的抑制實(shí)驗(yàn)。
　　通過Race技術(shù)獲得SjPorcn蛋白基因的全序列;其編碼的氨基酸序列存在三個(gè)高度保守的氨基酸殘基;利用RNA干擾SjPorcn，使其表達(dá)下調(diào)，也可引起類似C59對(duì)蟲體Wnt信號(hào)通路產(chǎn)生的作用，導(dǎo)致Wnt/β-

6、catenin、Wnt/PCP及Wnt/Ca2+信號(hào)通路不同程度的抑制。
　　克隆鑒定了日本血吸蟲的Wntless基因(SjWls)。序列分析顯示，SjWls氨基酸序列羧基末端為KEAFE并有一個(gè)保守的賴氨酸殘基，該序列可能與SjWls的亞細(xì)胞定位相關(guān)。SjWls蛋白在蟲體的組織定位分析，結(jié)果顯示SjWls蛋白廣泛分布于蟲體吸盤、抱雌溝及生殖器官等組織中，表明Wls蛋白在各個(gè)組織中都有分布。利用RNA干擾SjWls，使其表達(dá)下調(diào)可

7、以引起Wnt/β-catenin、Wnt/PCP及Wnt/Ca2+信號(hào)通路不同程度的抑制。
　　2.日本血吸蟲Wnt1基因鑒定及在不同發(fā)育階段表達(dá)水平分析
　　克隆鑒定了日本血吸蟲的Wnt1基因(SjWnt1)。序列分析顯示，SjWnt1蛋白有Wnt信號(hào)蛋白家族的結(jié)構(gòu)功能域，但比高等生物的Wnt1少一個(gè)保守的Cys。mRNA和蛋白的定量分析結(jié)果顯示，SjWnt1表達(dá)于血吸蟲的整個(gè)發(fā)育過程，而在蟲卵和早期童蟲中呈高表達(dá)水平，提

8、示SjWnt1對(duì)卵胚發(fā)育和早期童蟲的細(xì)胞分化具有調(diào)節(jié)作用。來源于非適宜宿主及單性感染的發(fā)育不良蟲體中SjWnt1 mRNA水平比發(fā)育正常的蟲體高，表明不良發(fā)育的蟲體相應(yīng)的Wnt信號(hào)阻滯。SjWnt1表達(dá)下調(diào)后則引起Wnt/β-catenin、Wnt/PCP及Wnt/Ca2+通路的相應(yīng)下游基因的mRNA水平下降，推測(cè)SjWnt1可能通過這3種傳遞途徑行使信號(hào)傳遞的功能。
　　本文開展了日本血吸蟲Wnt分泌相關(guān)基因的抑制研究。確定了P

9、orcn蛋白的專性抑制物C59的最佳作用濃度及時(shí)效，并分析了C59對(duì)體、內(nèi)外童蟲Wnt信號(hào)通路的抑制效果。篩選出兩個(gè)Wnt蛋白分泌相關(guān)基因:Porcn及Wls的siRNA，并分析了Porcn及Wls基因下調(diào)對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制效果。為從整體上抑制血吸蟲的Wnt家族蛋白，探討該通路對(duì)血吸蟲生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)制建立了實(shí)驗(yàn)方法。另外，在前期研究工作的基礎(chǔ)上，對(duì)SjWnt1進(jìn)行了鑒定和分析，為認(rèn)識(shí)SjWnt1在血吸蟲發(fā)育中的調(diào)節(jié)功能提供實(shí)驗(yàn)