慢病毒載體介導的Il-10誘導小鼠骨髓來源耐受性樹突狀細胞的形成.pdf

1、目的：探索體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源未成熟樹突狀細胞(immature dendriticcells，imDCs)的實驗條件和方法。探討重組IL-10慢病毒載體轉染小鼠imDCs，構建高分泌IL-10的耐受性樹突狀細胞(tolerogenic dendritic cells，Tol-DCs)的可行性。
　　 方法：無菌條件下體外分離獲得小鼠骨髓來源單核細胞，通過低劑量重組小鼠粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重組白細胞介

2、素4(rmlL-4)聯(lián)合誘導并經CD11c免疫磁珠分選的方法獲得小鼠imDCs，取部分細胞加入腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激誘導為成熟樹突狀細胞(mature dendritic cells，mDCs)。倒置顯微鏡下觀察DC形態(tài)變化，流式細胞術分析比較imDCs和mDCs的表型差異。IL-10重組慢病毒載體轉染小鼠imDCs，同時設計GFP慢病毒轉染DC陽性對照組和未轉染DC陰性對照組，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達，

3、通過ELISA法檢測各組轉染細胞的IL-10表達情況。將IL-10重組慢病毒轉染imDCs和未轉染imDCs分別行混合淋巴細胞反應，觀察T淋巴細胞增殖情況，然后分別取反應細胞與刺激細胞比例為1:10的細胞混合液，同時設計未加imDCs的單一T細胞陰性對照組，行流式細胞術分析三組調節(jié)性T細胞比例的變化。
　　 結果：利用低劑量rmGM-CSF和rmlL-4聯(lián)合誘導小鼠骨髓來源前體細胞并經CD11c免疫磁珠分選的方法，獲得了大量高純

4、度的imDCs，細胞隨培養(yǎng)時間的延長表現(xiàn)出典型的樹突狀形態(tài)，流式細胞術結果顯示imDCs與mDCs比較，細胞表面MHCⅡ、CD80、CD86因子表達水平均顯著低于后者。IL-10慢病毒轉染imDCs后，熒光顯微鏡下觀察細胞GFP高度表達，ELISA結果顯示IL-10轉染DC組的IL-10表達水平明顯高于GFP轉染組及未轉染空白對照組(P<0.001)，GFP轉染組與空白對照組均低水平分泌IL-10，之間無明顯差異(P=0.997，>0.

5、05)?；旌狭馨图毎磻傲魇郊毎g結果分別提示imDCs經IL-10重組慢病毒轉染后其刺激T細胞增殖能力減弱(P<0.01)，而調節(jié)性T細胞比例得到提高(P<0.01)。
　　 結論：采用低劑量GM-CSF和IL-4細胞因子聯(lián)合誘導小鼠骨髓單核細胞的方法，獲得了低表達共刺激因子的未成熟樹突狀細胞。將IL-10重組慢病毒載體轉染小鼠未成熟樹突狀細胞，所轉導的IL-10基因在未成熟樹突狀細胞內高效、穩(wěn)定地表達。基因修飾后的未成熟樹