腺病毒重組CTLA4Ig和α4β7誘導(dǎo)的耐受性樹突狀細(xì)胞治療食物過敏的研究.pdf

1、第一部分 腺病毒重組CTLA41g、α4β7基因修飾樹突狀細(xì)胞 目的：通過擴(kuò)增AdCTLA4Ig和Adα4β7確定AdCTLA4Ig和Adα4β7的感染效率，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CTLA4Ig和α4β7基因的耐受性樹突狀細(xì)胞疫苗。 方法：AdCTLA4Ig和Adα4β7轉(zhuǎn)染293細(xì)胞擴(kuò)增腺病毒，TCID50（50％組織培養(yǎng)感染量）法測病毒滴度。取小鼠脛骨及股骨骨髓制成細(xì)胞懸液，分離出單個核細(xì)胞，在GM-CSF及IL-4作

2、用下培養(yǎng)7天，在光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化。流式細(xì)胞術(shù)（FCM）鑒定為樹突狀細(xì)胞后，感染AdCTLA4Ig和Adα4β7。熒光顯微鏡下觀察目的基因表達(dá)，F(xiàn)CM鑒定不同階段DC表面標(biāo)志表達(dá)。 結(jié)果：TCID50測AdCTLA4Ig和Adα4β7轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的病毒滴度分別為5.01×108pfu/ml、4.8×108pfu/ml。42％左右細(xì)胞具有CD11c表型，確定為樹突狀細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察約80％DC表達(dá)CTLA4Ig和

3、α4β7，當(dāng)MOI為50時，感染效率最高。FCM檢測結(jié)果顯示經(jīng)AdCTLA4Ig和Adα4β7共感染的DC表面標(biāo)志CD86下降明顯，而MHCⅡ無改變。 結(jié)論：腺病毒重組CTLA4Ig、α4β7修飾樹突狀細(xì)胞可使其同時表達(dá)CTLA4Ig和α4β7兩種蛋白，具有耐受性DC的表型，共刺激分子CD86表達(dá)減少，而MHCⅡ無改變。 第二部分耐受性樹突狀細(xì)胞預(yù)防和治療食物過敏的實(shí)驗(yàn)研究 目的：通過小鼠尾靜脈將重組AdCTLA

4、4Ig和Adα4β7誘導(dǎo)的耐受性DC回輸于食物（OVA）過敏小鼠體內(nèi)，觀察其對食物過敏小鼠的預(yù)防、治療效果，為臨床治療兒童食物過敏提供新的思路。 方法：對象：選用無雞蛋喂養(yǎng)4～6周齡的SPF級BALA/c雌鼠48只為實(shí)驗(yàn)對象，隨機(jī)分為6組?；A(chǔ)致敏24小時后回輸耐受性DC為預(yù)防組（P組）；腸道激發(fā)4小時后回輸DC為治療組（T組）；預(yù)防組和治療組按照回輸AdCTLA4IgDC和AdCTLA4Ig/Adα4β7DC分為預(yù)防1組（P1

5、組）、預(yù)防2組（P2組）和治療1組（T1組）、治療2組（T2組）；同時設(shè)置生理鹽水為陰性對照組和OVA過敏小鼠為陽性對照組。方法：（1）觀察各組癥狀表現(xiàn)；（2）HE染色及甲苯胺蘭觀察各組小腸組織形態(tài)學(xué)變化；（3）ELISA法檢測血清中OVA特異性IgE水平；（4）免疫組化法檢測小鼠小腸組織中IL-10；（5）免疫熒光法檢測TGF-β表達(dá)水平；（6）免疫熒光檢測小腸組織中α4β7表達(dá)。 結(jié)果： T1及T2組小鼠經(jīng)尾靜脈注射耐受性D

6、C對OVA介導(dǎo)的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)有緩解作用，其中T1組有75％（6/8）、T2組有87.5％（7/8）過敏小鼠腹瀉情況減輕；OVA特異性IgE水平明顯降低；HE染色可見兩組小腸絨毛中上皮細(xì)胞局灶性壞死、脫落，固有層炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象明顯改善；肥大細(xì)胞聚集和脫顆?，F(xiàn)象改善，IL-10表達(dá)增高。P1、P2組較陽性對照組無明顯改善。各組TGF-β表達(dá)無差異。免疫熒光檢測T2組小鼠小腸組織中α4β7表達(dá)高于其他各組。 結(jié)論：尾靜脈回輸AdC